右美托咪定對卵巢癌細胞相關生物學行為的影響

連紅梅，姜麗華

0 引言

卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中居首位[1]。由于早期卵巢癌體征和癥狀不典型，而且缺乏有效的檢測手段，大多數患者發展到疾病晚期才能被診斷[2]。許多患者初次被診斷時就已經發生了轉移[3]。卵巢癌的治療通常包括手術治療和化療[4]，有時也會采取放射治療[5]。大部分的卵巢癌患者需要進行全面分期手術、腫瘤減滅術[6]，而術后需要補充化療的患者占比較大[7]，對于Ⅱ～Ⅳ期患者，如果殘留病灶可以切除，推薦行減瘤術。如果懷疑有無法切除的殘留病灶，可選擇直接化療6～8個療程，也可先行3個療程化療，再行全面分期手術，術后再化療[8]。隨著腫瘤治療的多樣化發展，免疫治療[9]、激素治療[10]等也越來越多地被應用到卵巢癌的治療中，但是效果并不理想，并沒有使患者的生存率顯著提升[11]。

右美托咪定是高度選擇性的α2腎上腺素能激動劑，是一類抗焦慮、鎮靜、止痛類藥物[12]。與阿片類藥物和其他常用的鎮靜劑(如：丙泊酚、芬太尼和咪達唑侖)不同，右美托咪定能夠達到同樣的鎮靜效果而不引起呼吸抑制[13]。右美托咪定可以讓用藥者在鎮靜過程中有一定的自主呼吸，從而減少了呼吸抑制的風險[14]。除了自身的鎮靜麻醉效果外，嗎啡[15]、丙泊酚[16]、咪達唑侖[17]、地西泮[18]、舒芬太尼[19]、曲馬多[20]等許多經典的鎮靜鎮痛藥物均具有一定的抗腫瘤作用，而右美托咪定卻鮮有研究。

本文通過卵巢癌SKOV3細胞研究右美托咪定對其細胞相關生物學行為的影響，探究右美托咪定在卵巢癌治療中的潛能，為卵巢癌的輔助治療，特別是在手術過程中和重癥監護室中鎮靜麻醉藥物的選擇提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3由上海細胞生物研究所提供。RPMI-1640培養液、10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細胞在含有10% FBS、100 mg/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的培養基中培養，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，生長至80%左右時進行傳代和凍存，用于后續的實驗。細胞培養瓶和96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。

1.2 藥物和試劑 右美托咪定購自南京萊富賽生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海美季生物技術有限公司。

1.3 細胞活性的測定 使用CCK-8試劑盒測定細胞的活性。將SKOV3卵巢癌細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞和100 μL培養基。在37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育24 h。更換新培養基。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L濃度右美托咪定處理24 h。處理后，將96孔板中的培養基用新鮮培養基替換。加入20 μL的CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶標儀板在490 nm波長下測量不同組的OD值。

1.4 細胞凋亡實驗檢測SKOV3卵巢癌細胞的凋亡 流式細胞術FITC-Annexin V/PI雙染色是理想的定量測定細胞凋亡的方法。將SKOV3卵巢癌細胞以2×106的密度接種在6孔板中細胞/孔并生長24 h。用不同濃度(0、1、10、100 nmol/L)的右美托咪定處理24 h。加入100 μL細胞懸液5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，并將細胞在黑暗中孵育30 min。PI (5 μL，濃度為10 μg/mL)加入細胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細胞術評估細胞以識別細胞周期的變化。

1.5 劃痕愈合實驗 將SKOV3卵巢癌細胞(48 h)進行胰蛋白酶消化，并將適量細胞平鋪在6孔板上。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L右美托咪定處理。使用200 μL無菌槍頭輕劃孔板，每個孔劃4～5次，盡量保證所劃線處于平行狀態，放置37 ℃恒溫細胞培育箱，48 h后，分別用適量PBS沖洗孔板，顯微鏡下觀察SKOV3卵巢癌細胞遷移的距離，然后對比各組之間的差異。

1.6 Transwell侵襲實驗 通過Transwell對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力測定。將SKOV3卵巢癌細胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L右美托咪定處理。24 h后，在沒有FBS或HGF的DMEM中的2×105個饑餓過的細胞，用含有基質膠的小室(直徑6.5 μm，孔徑8 μm，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS的培養基置于下腔中。在37 ℃下孵育48 h后，小心去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈后，于倒置顯微鏡下計數。獨立3次測定后取其平均值。

2 結果

2.1 右美托咪定對SKOV3細胞活性的影響 如圖1所示，在各個不同的處理時間組中，SKOV3細胞活性隨著右美托咪定濃度的上升而下降。在12 h處理組中，右美托咪定濃度達到100 nmol/L時，SKOV3細胞活性下降了9% (P<0.05)。在24 h和48 h處理組中，當右美托咪定的濃度達到10 nmol/L，細胞活性分別下降了16%和20% (P<0.01)，當濃度為100 nmol/L時，細胞活性下降了18%和22% (P<0.01)。結果表明，SKOV3卵巢癌細胞的生長增殖能被右美托咪定抑制，最低作用濃度是10 nmol/L，最短的作用時間是12 h。

2.2 右美托咪定誘導SKOV3卵巢癌細胞凋亡 應用Annexin V-FITC和PI對細胞進行染色，再通過流式細胞學技術進行分析。如圖2所示，存活的細胞位于左下象限，而凋亡的細胞位于右下象限。隨著右美托咪定濃度的升高，凋亡細胞的百分比隨之上升。當右美托咪定濃度達到10、100 nmol/L，凋亡率分別為8.21%、8.30%，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明，右美托咪定能誘導SKOV3卵巢癌細胞凋亡。

圖1 不同濃度右美托咪定在不同作用時間下對SKOV3卵巢癌細胞活性的影響

2.3 劃痕愈合實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞遷移能力的影響 如圖3所示，與對照組相比，右美托咪定處理后SKOV3卵巢癌細胞的遷移能力明顯下降。此外，右美托咪定的濃度越高，遷移的速率越慢。當用10、100 nmol/L濃度的右美托咪定處理時，SKOV3卵巢癌細胞的遷移率較對照組分別下降了12% (P<0.05)和25% (P<0.01)，表明右美托咪定能抑制SKOV3細胞遷移能力。

2.4 Transwell侵襲實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力的影響 如圖4所示，SKOV3卵巢癌細胞在經過不同濃度的右美托咪定處理后，細胞的侵襲能力顯著下降，而且隨著濃度的上升，侵襲細胞的數量下降更為明顯。10、100 nmol/L右美托咪定處理時，SKOV3卵巢癌細胞的侵襲率較對照組分別下降了18%(P<0.05)和28%(P<0.01)，表明右美托咪定削弱SKOV3細胞侵襲能力。

圖2 流式細胞術檢測右美托咪定誘導SKOV3卵巢癌細胞凋亡

圖3 劃痕愈合實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞遷移能力的影響

圖4Transwell侵襲實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

根據美國SEER的統計結果顯示，全球每年大約有22 240名女性被診斷為卵巢癌，其中有將近14 000名患者死于該病[21]。許多卵巢癌患者在初次診斷時就已經處于中晚期，失去了直接手術的機會，從而開始接受以鉑類藥物為主的全程化療或新輔助化療[22]。在這些無法手術接受化療的患者中，大概有50%對一線化療藥物有效，中位生存時間為18個月[23]。而有20%～30%的患者在接受初次化療時就已經出現了耐藥情況[24]。約25%的患者在初次化療后6個月病情復發，屬于鉑類耐藥[25]。

研究表明，以下藥物也具有一定的抗腫瘤效應，如二甲雙胍[26-28]、阿司匹林[29]、米非司酮[30]等。Chen等[18]研究發現，地西泮能通過觸發G0/G1細胞周期停止，抑制人惡性膠質瘤細胞GBM T98G的增生。Guo等[31]將丙泊酚作用于人食管癌(ESCC) EC-1細胞，發現丙泊酚是通過調節S100A4的表達來影響細胞的生物學行為。

右美托咪定已經廣泛應用于手術和重癥監護室中[32]。Xia等[33]研究顯示，右美托咪定能通過激活α2腎上腺素受體/ERK信號通路來調節乳腺癌細胞的生物學行為。結果表明，右美托咪定能促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和遷移。Takefumi等[34]發現，用催眠劑量的右美托咪定處理小鼠，可使小鼠體內抗原呈遞細胞產生的IL-12減少，降低抗腫瘤免疫力，導致Th2的轉變并削弱CTL的活性。而本研究結果顯示，右美托咪定在SKOV3卵巢癌細胞中起抑制作用。

本研究中，細胞增殖實驗結果顯示，右美托咪定能抑制SKOV3卵巢癌細胞的活性，且其對SKOV3卵巢癌細胞活性的抑制呈劑量依賴性和時間依賴性。右美托咪定100 nmol/L處理SKOV3卵巢癌細胞48 h后，細胞活性下降22%。細胞凋亡是一種使細胞發生程序性死亡的病理生理過程，目的是為了去除損壞的細胞[35]。實驗證實，卵巢癌SKOV3細胞的凋亡率隨著右美托咪定濃度的升高而升高。當右美托咪定濃度達到10、100 nmol/L時，凋亡率分別為8.21%和8.30%，差異有統計學意義。結果表明，右美托咪定能誘導SKOV3卵巢癌細胞凋亡。此外，右美托咪定能抑制SKOV3卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。

但本實驗結果僅限于針對SKOV3卵巢癌細胞進行初步研究，未檢測其他卵巢癌細胞株的作用效果，并未對其機制進行深入研究，且缺乏體內實驗證據支持。因此，右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞的作用機制及體內和臨床試驗效果有待于進一步的研究。

綜上所述，右美托咪定能通過細胞凋亡抑制SKOV3卵巢癌細胞的活性，降低細胞的遷移和侵襲能力。右美托咪定在卵巢癌治療中可能具有一定的作用，可以作為手術和重癥監護室鎮靜麻醉藥物的優先選擇。

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