排草香細胞毒性及木犀草素含量的測定

楊 芳，吳澤幼，包 思，梁 敬

0 引言

排草香[Anisochiluscarnosus(L.f.) Benth. et Wall]為報春花科排草屬植物細梗香草(LysimachiacapillipesHemsl)的全草，為一年生草本植物，原產地印度，在我國多分布于廣西、廣東、湖南等地，具有祛風、止咳、調經的功效，主要用于胃潰瘍及皮膚類疾病的治療[1-2]。研究表明，排草香中主要藥理活性成分為黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用[3]。近年來，針對其藥理活性成分的抗腫瘤作用研究雖然取得了一定的進展，但針對其具體活性成分仍未得到明確闡述[4]。本研究通過測定排草香不同溶劑提取物對人胃癌細胞MGC-803的細胞毒性，并建立高效液相色譜(HPLC)法測定其中所含木犀草素的含量，以探討排草香的細胞毒性與木犀草素含量之間的關系，以期為排草香抗腫瘤活性的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胃癌細胞MGC-803細胞，購于上海慧穎生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 排草香，批號：161201，由廣東致信藥業股份有限公司提供，經廣州中醫藥大學生藥教研室杜勤教授鑒定為報春花科排草屬植物細梗香草(LysimachiacapillipesHemsl)的全草；紫杉醇，國藥準字：H20067344，規格：30 mg*1支/盒，購于江蘇紅豆杉藥業有限公司；木犀草素對照品，批號：111520-200201，規格：20 mg/支，純度≥95%，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試劑盒及試劑 DMEM培養液，購于美國Hyclone公司；胎牛血清，購于江蘇科特生物科技有限公司；胰蛋白酶，購自賽奧生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT),磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)，均購于美國Sigma公司；乙腈、甲醇：色譜級，購于德國默克；其他試劑均為分析級，購于廣東光華化學試劑廠。

1.1.4 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M2OA二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，LC-solution工作站；實驗室超純水系統，型號：MU4100P，上海淼康實業公司；HH-6A磁力攪拌水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；R-100旋轉蒸發儀，瑞士布琦。

1.2 樣品制備

1.2.1 水提物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量水室溫浸提2 d后過濾，再于濾渣中加10倍量水室溫浸提2 d，過濾，合并2次濾液，水浴濃縮至干，得排草香水提物(5.5%，W/W)。

1.2.2 醇提物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量95%乙醇索氏回流(85 ℃)提取2次，每次6 h，合并2次提取液，以70 ℃水浴減壓濃縮至干，得排草香醇提物(8.6%，W/W)。

1.2.3 乙醚提取物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量乙醚索氏回流(40 ℃)提取2次，每次6 h，合并2次提取液，以30 ℃水浴減壓濃縮至干，得排草香醚提物(10.2%，W/W)。

1.3 細胞培養 取出凍存于-80 ℃液氮罐中的細胞，快速置于37 ℃溫水中融化細胞進行復蘇；于MGC-803細胞培養瓶中加入DMEM生長液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每天換液。待細胞生長至鋪滿瓶底80%～90%的單層細胞時，棄去培養液，加入適量胰蛋白酶消化2～3 min后，加入DMEM培養液終止消化，得單層細胞，取對數生長期生長良好的細胞，以PBS清洗2～3次，轉移至新的培養瓶中進行傳代培養。將對數生長期的細胞以DMEM培養液稀釋后，使細胞密度在計數板上計數為2×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養為單層細胞。每次傳代培養及實驗用的細胞均為處于對數生長期細胞。

1.4 MTT法檢測細胞存活率 采用MTT法測定細胞毒性：以含2%胎牛血清的DMEM培養液分別將各溶劑提取物稀釋為不同濃度(25、50、100、200 μg/mL)的樣品培養液。以樣品培養液替換長有單層細胞的96孔板中的培養液，每個濃度平行接種3孔，每孔100 μL，為樣品組。同時以不同濃度(6.25、12.5、25、50 μg/mL)的紫杉醇組為陽性對照組，設正常培養液組作為空白對照組(每孔加含2%胎牛血清的DMEM培養液100 μL)。將上述各組細胞均置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h。再于每孔加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h后棄去培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，使完全溶解。采用酶標儀于570 nm下測定隔空的吸光度值(OD570)，并按照公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=100-[(OD對照組) -(OD樣品組)/(OD對照組)]×100。

1.5 SRB法檢測細胞存活率 采用SRB比色法測定細胞毒性：將96孔板中的細胞培養液分別以不同濃度(25、50、100、200 μg/mL)的樣品培養液替換，為樣品組。同時以不同濃度(6.25、12.5、25、50 μg/mL)的紫杉醇組為陽性對照組，設正常培養液組作為空白對照組(每孔加含2%胎牛血清的DMEM培養液100 μL)。將上述各組細胞均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入10%三氯乙酸100 μL，并于4 ℃條件下反應1 h，以蒸餾水洗滌3～5次并干燥。再于每孔分別加入0.05%的SRB冰乙酸溶液(1%，V/V)100 μL，置于室溫條件下染色處理30 min，再以1%冰乙酸溶液洗滌3～5次，甩干。每孔加入10 mmol/L的Tris-base (pH=10.5) 200 μL，置于震蕩器中振蕩處理10 min，使SRB完全溶解。采用酶標儀于570 nm波長處測定隔空的吸光度值(OD570)，并按照公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=100-[(OD對照組)-(OD樣品組)/(OD對照組)]×100。

1.6 木犀草素含量測定

1.6.1 對照品溶液的配制 精密稱定木犀草素對照品20.17 mg于25 mL量瓶中，以色譜甲醇溶解定容至刻度，制成每1 mL中含0.77 mg的溶液，作為木犀草素對照品母液。

1.6.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取各溶劑提取物50 mg于5 mL量瓶中，以少量色譜甲醇超聲溶解并定容至刻度，混勻得10 mg/mL的供試品溶液。

1.6.3 色譜條件 色譜柱：YMC-Hydroshpere C18柱(250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸(40∶60)等度洗脫；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。

1.6.4 線性關系考察 取木犀草素對照品母液分別配制成濃度為0.77、0.38、0.19、0.15、0.08、0.04、0.03 mg/mL的一系列對照品溶液，按上述色譜條件測定。以木犀草素濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.5 精密度考察 精密吸取木犀草素對照品母液連續進樣6針，并計算RSD值。

1.6.6 重復性考察 取同一份樣品，平行稱取6份，按照“1.6.2”制備供試品溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中，按照“1.6.3”色譜條件進樣測定，計算RSD值。

1.6.7 加樣回收率考察 分別取上述重復性已知含量樣品，以1∶1的比例添加木犀草素對照品，平行6份，分別計算回收率及RSD值。

1.6.8 穩定性考察 分別將樣品置于常溫(25 ℃)條件下0、2、4、6、8、12 h，測定含量，并計算RSD值。

1.6.9 樣品測定 分別按照“1.6.2”制備供試品溶液，各平行3份，以0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中，按照“1.6.3”色譜條件進樣測定，計算平均百分含量。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞存活率結果 排草香各提取物組及紫杉醇組均對MGC-803細胞顯示出一定的毒性，經IC50對比各組細胞毒性：紫杉醇>醚提物>醇提物>水提物；醚提物及醇提物組的細胞毒性均顯著高于水提物組(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 MTT法檢測排草香提取物對MGC-803細胞的毒性結果

2.2 SRB法檢測細胞存活率結果 排草香各提取物組及紫杉醇組均對MGC-803細胞顯示出一定的毒性，經IC50對比各組細胞毒性：紫杉醇>醚提物>醇提物>水提物；醚提物及醇提物組的細胞毒性均顯著高于水提物組(P<0.05)，與MTT法檢測結果一致，見表2、圖2。

表1 MTT法檢測各組對MGC-803細胞的毒性結果

圖2 SRB法檢測排草香提取物對MGC-803細胞的毒性結果

2.3 方法學考察測定 按“1.6.3”色譜條件測定，以木犀草素濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=46 131 X+18.99 (r=0.999 9，n=7)，木犀草素的檢測濃度線性范圍為0.03～0.77 mg/mL。精密度試驗RSD為0.17% (n=6)，儀器精密度良好，見圖3A。重復性試驗RSD為0.32% (n=6)，目標峰分離度較好，重復性良好，見圖3B。加樣回收試驗平均回收率為101.13% (RSD=1.43%，n=6)。穩定性試驗RSD為0.16% (n=6)。上述結果表明，供試品制備及色譜條件穩定可行，可供樣品含量測定。

2.4 樣品測定 以經方法學驗證的“1.6.3”色譜條件測定排草香各提取物中木犀草素的含量：醚提物>醇提物>水提物，見表3。

3 討論

排草香，又名排草、香排草、香草，商品名亦稱小葉靈香草，作為傳統中藥，其又具有多種藥理功效，如化痰止咳、祛風除濕、補氣養血、緩急止痛等[5-6]。近年來，隨著對其所含化學成分及藥理藥效的深入研究表明，排草香具有較顯著的保護肝臟、抗菌、抗炎及抗腫瘤等藥理作用，其中最受研究者矚目的當屬其抗腫瘤活性的研究，但具體抗腫瘤的活性成分目前尚不明確[7]。研究表明，排草香中所含的主要藥理活性成分為黃酮類化合物[6]，主要為黃酮醇及黃酮苷，包括山奈酚、槲皮素、香草苷1級及2級等，目前針對黃酮類化合物的抗腫瘤活性成分研究較為廣泛，張杜宇等[8]研究表明，總黃酮類化合物能顯著抑制人類乳腺癌細胞的增殖，提示其顯著的抗癌作用。孫錦秀等[9]研究表明，總黃酮具有誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用；Du等[10]研究表明，總黃酮能顯著抑制人結腸癌HT-29及SW-480細胞株的生長，均表明總黃酮具有顯著抗腫瘤活性。但針對排草香中總黃酮類抗腫瘤活性中的具體成分，目前尚不清楚。

圖3 木犀草素測定圖譜

研究表明，總黃酮中的木犀草素具有顯著的抗腫瘤活性，且其抗腫瘤作用具有多靶點、多途徑、多環節的特點[11-12]。Verschooten等[13]研究表明，木犀草素可以通過下調PLK1的表達，抑制增殖相關基因的表達，實現對腫瘤細胞增殖的抑制作用。Lee等[14]研究表明，木犀草素能通過參與誘導人肺癌細胞CH27的凋亡實現抗腫瘤作用。胡春萍等[15]研究表明，木犀草素可通過誘導非小細胞肺癌細胞株A549凋亡及阻滯G2周期實現抗腫瘤細胞活性。王洪燕等[16]研究表明，木犀草素與化療藥物聯合使用，能產生增敏效應，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，增強藥物抗腫瘤療效。Muthuraman等[17]采用EAC法測定細胞毒性表明，排草香醇提物具有顯著的細胞毒性。Kiruthiga等[18]研究表明，排草香醇提物能夠通過調控線粒體膜蛋白及增加活性氧誘導肺癌細胞A549凋亡。本研究采用MTT法及SRB法測定排草香不同提取物組及紫杉醇組對人胃癌細胞MGC-803的細胞毒性，經IC50對比，各組細胞毒性由高到低依次為：紫杉醇組>醚提物組>醇提物組>水提物組，且排草香醚提物及醇提物組的細胞毒性均顯著高于水提物組。兩種方法測定結果均與上述研究結果一致，提示排草香乙醇及乙醚提取物中含有某些具有抗腫瘤活性的成分。近年研究發現，排香草中皂苷成分同樣具有癌細胞抑制作用，LC-C單體成分對人體A-2780細胞具有顯著細胞毒作用，還可對人前列腺癌細胞PC3的生長進行劑量和時間依賴性抑制，并具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[19]。

表2 SRB法檢測各組對MGC-803細胞的毒性結果

表3 排草香提取物中木犀草素含量測定

本文通過建立穩定、準確的HPLC法，進行排草香水、乙醇及乙醚提取物中木犀草素含量的測定，結果表明，各提取物中木犀草素含量對比：乙醚提取物中含量最高，乙醇提取物次之，水提物中最低，與上述對人胃癌細胞MGC-803的細胞毒性作用具有較一致的趨勢，提示排草香的抗腫瘤活性可能與木犀草素含量有關，同時為抗癌藥物的研發提供一個新的方向。但本研究存在一定不足之處，即未對MGC-803的細胞毒性3種提取物中是否還含有黃酮類等其他活性成分，以及其對MGC-803細胞的毒性是否有共同作用進行探討，今后還需擴大黃酮類活性成分的監測范圍，對是否含有其他活性成分等加以觀察和分析。

綜上所述，排草香乙醇提物及乙醚提取物均具有顯著的抗腫瘤活性，可能與其中木犀草素的含量有關，但具體的作用機制仍待進一步研究。

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