近紅外光譜法用于半夏偽品鑒別

夏愛萍

0 引言

半夏為天南星科半夏屬半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.，又名地文、守田等，藥用部位為圓球形塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效[1]，為臨床常用中藥之一。有研究報道，半夏中所含的活性物質基礎包括生物堿、氨基酸、揮發油、有機酸、核苷等[2-4]。作為一種常用藥，半夏的臨床需求量大，但受限于產量低、野生資源匱乏及人工種植品的質量難以保證等限制，半夏的產量很難滿足臨床用量的需求[5]。因此，某些不法分子常會用與半夏同屬而不同種但產量高、價格低廉的掌葉半夏，甚至同科不同屬的水半夏、天南星冒充半夏使用[6-9]，極大地影響了臨床藥效和用藥安全。有學者利用HPLC法同時測定了多種來源半夏及其偽品中9種核苷類活性成分的含量，發現半夏中部分核苷類成分的含量與水半夏、天南星存在顯著差別[10]，因此可用HPLC法鑒別出上述2種偽品；但掌葉半夏與半夏中上述9種核苷類成分的含量無明顯差別，因此不能達到鑒別的目的。

本實驗采用近紅外光譜法，建立判別模型，對半夏和掌葉半夏進行了判別分析和聚類分析，成功對兩者進行了判別。

1 儀器及試藥

MPA-TM近紅外光譜儀(檢測器為InGaSe)，德國布魯克光學儀器公司。半夏樣品(共23批樣品)和掌葉半夏樣品(共12批樣品)均購自浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，并經朱濤副主任中藥師進行生藥學鑒定。

2 方法與結果

2.1 光譜采集 使用MPA-TM型近紅外光譜儀的漫反射組件，檢測器：InGaSe，數據分析軟件：DPS 7.55/OPUS/TQ Analyst。掃描波長范圍為10 000～4 000 cm-1，掃描次數為32次，分辨率為8 cm-1。半夏樣品和掌葉半夏樣品分別粉碎成粗粉(過20目篩)，取適量藥材粗粉，均勻地鋪滿樣品杯(50 mm×50 mm)杯底，每份樣品重復掃描3次，計算平均光譜，如圖1所示。

圖1 半夏和掌葉半夏近紅外光譜圖

2.2 判別分析 判別分析指利用樣品紅外光譜自身所具備的特征值作為依據，以判別其所歸屬的不同類型，是一種基于多變量統計的分類方法。在對不同樣品的紅外光譜進行預處理之后，選擇最具代表性和最具區分力的紅外光譜特征波段，以不同種類樣本間的馬氏距離作為判定依據，建立判別模型，之后采用未知樣品的紅外光譜數據與已有的判別模型進行擬合，得出未知樣品與校正集之間的馬氏距離，以此為依據進行辨別和歸屬[11]。

2.3 聚類分析 首先將每1個樣本都歸為1個單獨的類別，然后以在多維空間中的距離為判定依據，挑選出最為相似的一對樣本合并成1個新的類別，再計算新類別與其他所有類別的相似情況，選取其中最為相似的2個類別合并成1個新的類別，這樣就能每次減少1個類別，直到所有的樣本都歸為1個類別，從而達到分類的目的。不同樣本紅外光譜之間的距離表明對應樣本的相似度，兩張光譜之間的距離值隨著樣本差別的減小而減小、隨著樣本差別的增大而增大，相似樣本的紅外光譜以組的形式進行分類，再將組的形式以樹狀圖的方式表示[12]。

3 結果與分析

3.1 判別分析

3.1.1 預處理方法對判別結果的作用 在建立半夏判別模型之前，應先對原始圖譜進行預處理，以去除因為儀器誤差所引起的紅外光譜偏移或基線的漂移，提高半夏及掌葉半夏近紅外光譜數據和樣品性質兩者間的相關性[13]。目前對原始光譜的預處理方法主要有一階導數法、二階導數法、MSC、SNV等。光譜預處理結果見表1。

表1 不同光譜預處理對校正模型辨識結果的影響

由表1可知，選擇不同的波段和預處理方法，對判別結果-辨識率的影響非常顯著。建立模型之前，應先對波段進行篩選，既能去除某些波段噪音的影響，又能提高工作站的運算速度；MSC方法能夠消除因樣本的鏡面反射及不均勻性所產生的噪音；SNV方法是將紅外光譜數據進行歸一化運算處理后，有效去除了采集光譜時由于樣品散射效應所產生的噪音；導數法能夠顯著地去除基線漂移，并能通過對特征峰的銳化，顯著強化譜帶的特征，但其也會將部分噪音強化，降噪音放大，降低譜帶的信噪比[14]。因此，在6 600～5 400 cm-1波段，原始光譜結合MSC/SNV預處理方法的效果均非常理想，顯著優于原始光譜及其他預處理方法，校正集的辨識率能夠達到100%，兩組模型判別結果非常理想。采用原始光譜結合MSC/SNV的預處理方法均適用于半夏及其偽品掌葉半夏的判別分析。

3.1.2 模型的建立 按“3.1.1”項下方法，對全部35個校正集樣本采用原始光譜結合MSC/SNV的預處理方式，結合選定波段為6 600～5 400 cm-1，建立半夏與掌葉半夏近紅外光譜判別分析模型，見圖2。由圖2可知，在半夏樣品區域和掌葉半夏樣品區域內，均無被錯判樣本存在，對所有樣本的辨識率達100%。表明采用MSC或SNV方法對原始光譜進行預處理，均能夠較好地判別出半夏與掌葉半夏，實現半夏與其偽品掌葉半夏的鑒別。

3.1.3 模型驗證分析 用上述兩組紅外光譜判別模型對預測集的6個樣本分別進行判別分析，相應的分析結果見表2。

圖2 半夏樣品判別分析結果

表2 6個驗證樣品判別預測分析結果

由表2可知，所有6個預測集樣本中均未出現錯誤辨識，辨識的正確率為100%，說明在波段6 600～5 400 cm-1范圍內，采用MSC或SNV預處理，能很好地判別半夏的真偽，可建立半夏的近紅外指紋圖譜。

3.2 聚類分析 將半夏及掌葉半夏樣品原始光譜的波長及該波長的吸光度進行擬合，得到新的紅外數據，再使用DPS 7.55軟件中的聚類分析模塊對新的紅外數據進行處理，最終得到聚類分析的樹狀圖，見圖3。

圖3 半夏及掌葉半夏聚類分析結果

由圖3可知，以距離系數560為判定距離進行劃分，將半夏樣品歸成一類，掌葉半夏樣品歸成另一類。其中，有1個半夏樣本發生了誤判。誤判樣本為21號半夏，其產地為河南澠池，造成誤判的原因暫不明確，還需進一步研究。半夏樣品近紅外光譜聚類分析判定結果的準確率為96.9%，聚類分析的判定結果較好，基本能夠達到鑒別所需，證明利用聚類分析的方法對半夏及其偽品掌葉半夏的鑒別是可行的。

4 討論

HPLC法涉及供試品中活性成分的提取、富集等，由于提取條件等因素所限，無法將藥材中所有的活性成分提取出來；同時，已存在于供試液中的活性成分也無法全部體現在圖譜中。因此，采用HPLC法僅能分辨出與半夏差別較大的偽品-水半夏及天南星[10]，而對與半夏差別不大的掌葉半夏，則無法達到區分的目的。

近紅外光譜法是一種全成分分析法，可有效體現出藥材中全部活性成分的變化，因此在分辨一些差別較小的樣品時，具有很大的優勢。近紅外光譜法結合強大的數據處理技術，在中藥材的鑒別方面具有快速、客觀、無損等優勢，作為中藥材鑒別的一種新手段，具有廣闊的應用前景。但上述優勢是建立在相關的識別模型可靠的基礎之上，建立上述模型需要選取不同來源的、具有代表性的樣品建立模型，盡可能地擴大樣本量，并結合相應技術，剔除掉異常樣本，以提高模型的準確性和可靠性，否則容易出現誤判的現象。

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