參茸益精片對高脂血癥大鼠的影響及分子機制研究

王自勤，王海偉，蘇 丹，霍 堅，呂宏迪*

0 引言

近年來，高脂血癥(Hyperlipidemia)臨床發病率持續增高，對人類身體健康危害嚴重。高脂血癥主要引起血膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白升高或高密度脂蛋白降低，其發生的分子機制復雜，影響因素眾多，遺傳基因和外界環境均會產生顯著的影響，是一種體內脂類物質代謝紊亂所引起的全身慢性疾病[1-2]。高血壓、糖尿病、胰島素抵抗等代謝異常性疾病與高脂血癥的發病密切相關[3-4]。闡明高脂血癥發生、發展的分子機制，探尋有效的臨床治療靶點和預防治療方案，是目前本領域國內外研究的熱點。

參茸益精片主要由西洋參、黃芪等14味中藥組成，具有復脈固脫、補脾益肝、生津養血、安神益智壯腎陽、益精血、強筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常規治療后以及腫瘤患者放化療后白細胞減少、血紅蛋白低、高原反應及消化不良等癥[5-7]。但參茸益精片是否可以影響高脂血癥的臨床癥狀，其具體分子機制如何，目前尚未見相關報道。本實驗以大鼠高脂血癥動物模型為研究對象，通過Western blot和RT-PCR等實驗，觀察低密度脂蛋白受體(LDLR)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、VEGF蛋白和mRNA表達的變化，分析并闡明參茸益精片影響高脂血癥的分子機制，為其臨床應用提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 建立高脂血癥大鼠動物模型 SD大鼠(180～200 g)由一五九醫院實驗動物中心提供，隨機分為空白對照組(對照組)、高脂血癥模型組(模型組)、洛伐他汀治療組(洛伐他汀組，0.1 mg/kg)，參茸益精片治療組(低劑量組：0.1 mg/kg；中劑量組：0.5 mg/kg；高劑量組：1 mg/kg)，每組6只。模型組動物連續飼喂高脂飼料(20%蛋白粉，30%黃油，50%基礎飼料)，自由飲水，4周后檢測大鼠血脂水平[8]。治療組在飼喂高脂飼料的同時，口服灌胃不同劑量的參茸益精片，洛伐他汀作為陽性對照組，4周后檢測大鼠血脂水平和相關指標。

1.2 血脂水平分析 大鼠尾靜脈采血，按照試劑盒說明，分析血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.3 肝臟SOD和MDA活性分析 取大鼠肝臟，組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明，分析肝臟SOD和MDA的活性。

1.4 Western blot分析 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，PBS沖洗，加入裂解液，機械勻漿處理，12 000 r/min離心30 min。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%奶粉孵育1 h，封閉非特異性背景染色，再分別加入LDLR、VCAM-1和VEGF一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜后，與二抗室溫孵育2 h。ECL發光試劑盒發光顯影，收集圖像。

1.5 RT-PCR分析 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，TRIZOL法提取總RNA，通過RT-PCR分析LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA水平的變化。LDLR上游引物5′-GTGGTCTCGGCCCATCCA TCCCTGC-3′,下游引物5′-TGCGGCCACTCATCCGAGCCATCTT-3′；VCAM-1上游引物5′-ATCCCTACCATTGA AGATACTGG-3′，下游引物5′-TGATGACAGTTCTCCTTCTTTG-3′；VEGF上游引物5′-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3′,下游引物5′-CGAAACGCTGAGGGAGGCT-3′。β-actin上游引物:5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′,下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGC GGTG-3′,瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離RT-PCR產物，凝膠成像儀觀察圖像，分析組間差異。

2 結果

2.1 參茸益精片對高脂血癥大鼠血脂水平的影響 大鼠連續飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠血漿中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，提示大鼠高脂血癥動物模型符合實驗要求。與模型組比較，參茸益精片治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，并呈現一定的劑量依賴性，其效果與臨床高脂血癥的治療藥物洛伐他汀類似。見表1。

2.2 參茸益精片對高脂血癥大鼠肝臟SOD和MDA活性的影響 大鼠連續飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中SOD活性顯著降低，MDA活性顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，參茸益精片治療組SOD活性顯著增加，MDA活性顯著降低(P<0.05)，并呈現一定的劑量依賴性，其效果與臨床高脂血癥的治療藥物洛伐他汀類似。見表2。

2.3 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關分子蛋白表達的影響 本研究結果顯示，大鼠連續飼喂高脂飼料4周后，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中LDLR表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，

表1 參茸益精片對高脂血癥大鼠血脂水平的影響(nmol/L)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

參茸益精片治療組和洛伐他汀組大鼠肝臟中LDLR表達顯著增加(P<0.05)。與對照組比較，模型組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF表達均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，參茸益精片治療組VCAM-1和VEGF表達顯著降低(P<0.05)。見圖1。

表2 參茸益精片對高脂血癥大鼠肝臟SOD和MDA活性的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關分子蛋白表達的影響

注：1.對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.洛伐他汀組

2.4 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關分子mRNA表達的影響 RT-PCR結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF mRNA表達均明顯增加(P<0.05),而肝臟中LDLR mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，參茸益精片治療組大鼠主動脈VCAM-1和VEGF mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而肝臟中LDLR mRNA表達明顯增加(P<0.05)，洛伐他汀組LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA表達趨勢與參茸益精片治療組一致。見圖2。

3 討論

參茸益精片的主要有效成分是人參皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re和黃芪甲苷(Astragaloside A)，具有復脈固脫、補脾益肝、生津養血的功效，可以達到疏通脈管、改善臟器供血及調節人體代謝功能的目的[9-10]。本研究通過建立大鼠高脂血癥動物模型，觀察參茸益精片是否具有調節血脂水平的效果，同時通過分子生物學相關技術，分析血脂相關分子的變化，以闡明參茸益精片的作用機制，為其進一步的臨床應用提供實驗基礎和理論依據。

圖2 參茸益精片對高脂血癥大鼠相關分子mRNA表達的影響

注：1.對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.洛伐他汀組

本研究發現，大鼠連續飼喂高脂飼料4周后，血漿中TC、TG和LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低。同時給予參茸益精片治療的動物，其血脂水平相關的參數均與模型組有顯著的差異，并呈現一定的劑量依賴性。參茸益精片的上述降脂效應，與臨床常用的高脂血癥治療藥物洛伐他汀類似，提示參茸益精片具有潛在的臨床應用前景。

高脂血癥分子機制的研究及臨床治療藥物和預防手段的探索是目前國內外研究的熱點問題。研究結果表明，機體高脂血癥狀態下，肝臟易出現脂肪堆積，抗氧化能力降低，氧自由基水平顯著升高[11-12]。本研究結果表明，高脂飼料處理組的動物，肝臟MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，提示高脂動物肝臟清除氧自由基和脂質過氧化產物的能力顯著下降。而參茸益精片治療的動物，肝臟SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低，提示參茸益精片可以改善肝臟脂質過氧化的程度，減輕因高脂引起的過氧化物生成對肝臟的損傷，從而起到保護肝臟的作用，增強對血漿中TC、TG和LDL-C的處理能力。

基因的變化是引起高脂血癥的主要因素，同時也是臨床治療的藥物靶點和方向。大鼠肝臟中的LDLR、主動脈組織中的VCAM-1和VEGF均與高脂血癥密切相關，LDLR可與LDL結合，顯著降低LDL水平，VCAM-1和VEGF均與血管內皮細胞黏附和遷移的進程相關，能夠誘導相關細胞因子的表達，參與血管形成[13-18]。肝臟中LDLR的表達與LDL-C和膽固醇的代謝途徑密切相關，從而影響肝臟對血漿中TC、TG和LDL-C等的處理能力。增加LDLR水平，可顯著提高肝臟對膽固醇的降解能力，降低血脂水平。本研究結果表明，模型組LDLR表達顯著降低，而參茸益精片治療后，大鼠肝臟中LDLR表達顯著增加，提示參茸益精片能夠增加肝臟對膽固醇的降解，從而降低血脂水平。研究表明，高脂血癥可引起主動脈中VCAM-1和VEGF的高表達，促進內皮細胞黏附和遷移，誘導細胞因子表達，引起或加重動脈粥樣硬化斑塊的形成，造成機體的損害[17-18]。本研究結果表明，經過參茸益精片治療的動物，其主動脈中VCAM-1和VEGF的表達水平顯著降低，提示參茸益精片對主動脈血管有一定的保護作用。綜上所述，我們建立的高脂血癥的動物模型符合要求，可用于后續的研究。結果表明，給予參茸益精片治療的動物，其LDLR表達顯著增高，VCAM-1和VEGF表達顯著降低。RT-PCR實驗結果表明，上述分子的mRNA表達水平也體現一樣的趨勢。參茸益精片可以顯著改善機體的血脂水平，可能與調控肝臟和主動脈中相關分子的表達水平密切相關，對于高脂血癥，參茸益精片具有一定的治療效應。

參茸益精片能夠顯著抑制大鼠高脂血癥的發生，可能作為臨床治療并預防高脂血癥的藥物。本研究為參茸益精片的進一步臨床應用提供了實驗基礎和理論依據。

參考文獻：

[1] Gylling H,Simonen P.Phytosterols,phytostanols,and lipoprotein metabolism[J] .Nutrients,2015,7(9):7965-7977.

[2] Goderis G,Boland B.Cardiovascular prevention in type 2 diabetic patients:review of efficacious treatments[J] .Acta Clin Belg,2004,59(6):329-339.

[3] Patel RS,Scopelliti EM,Savelloni J.Therapeutic management of familial hypercholesterolemia:current and emerging drug therapies[J] .Pharmacotherapy,2015,35(12):1189-1203.

[4] Cicero AF,Colletti A,Borghi C.Profile of evolocumab and its potential in the treatment of hyperlipidemia[J] .Drug Des Devel Ther,2015,9:3073-3082.

[5] 徐泳芳,劉敏.人參、黃芪在仲景方中應用探析[J] .中國中醫急癥,2013,22(9):1557-1559.

[6] 汪晶,楊蕾,金鑫,等.黃芪甲苷對人參皂苷CK腫瘤細胞攝取及抗腫瘤作用的影響[J] .中草藥,2016,47(13):2308-2312.

[7] 劉月,初杰.人參黃芪的性味與配伍對方劑構成的影響[J] .遼寧中醫藥大學學報,2008,10(5):5-6.

[8] Benaicheta N,Labbaci FZ,Bouchenak M,et al.Effect of sardine proteins on hyperglycaemia,hyperlipidaemia and lecithin:cholesterol acyltransferase activity,in high-fat diet-induced type 2 diabetic rats[J] .Br J Nutr,2016,115(1):6-13.

[9] 黃小平,王蓓,邱詠園,等.黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應激損傷和促進能量代謝的配伍研究[J] .湖南中醫藥大學學報,2014,34(7):5-11.

[10] 杜芹芹,張旭,宋鳳瑞,等.人參與金銀花、何首烏、黃芪配伍的化學成分變化研究及抗氧化活性測定[J] .藥學學報,2010,45(6):756-760.

[11] Kim MH,Lee EJ,Cheon JM,et al.Antioxidant and hepatoprotective effects of fermented red ginseng against high fat diet-induced hyperlipidemia in rats[J] .Lab Anim Res,2016,32(4):217-223.

[12] Umar A,Iskandar G,Aikemu A,et al.Effects of Cydonia oblonga Miller leaf and fruit flavonoids on blood lipids and anti-oxydant potential in hyperlipidemia rats[J] .J Ethnopharmacol,2015,169:239-243.

[13] De Castro-Orós I,Solà R,Valls RM,et al.Genetic variants of LDLR and PCSK9 associated with variations in response to antihypercholesterolemic effects of armolipid plus with berberine[J] .PLoS One,2016,11(3):e0150785.

[14] Wang M,Gao M,Liao J,et al.Adipose tissue deficiency results in severe hyperlipidemia and atherosclerosis in the low-density lipoprotein receptor knockout mice[J] .Biochim Biophys Acta,2016,1861(5):410-418.

[15] Mahmoudabady M,Kazemi N,Niazmand S,et al.The effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on inflammatory and angiogenic factors in hypercholesterolemia[J] .Pharmacol Rep,2015,67(5):837-841.

[16] Lin HL,Yen HW,Hsieh SL,et al.Low-dose aspirin ameliorated hyperlipidemia,adhesion molecule,and chemokine production induced by high-fat diet in Sprague-Dawley rats[J] .Drug Dev Res,2014,75(2):97-106.

[17] Campa C,Alivernini G,Bolletta E,et al.Anti-VEGF therapy for retinal vein occlusions[J] .Curr Drug Targets,2016,17(3):328-336.

[18] Sun CY,Lee CC,Hsieh MF,et al.Clinical association of circulating VEGF-B levels with hyperlipidemia and target organ damage in type 2 diabetic patients[J] .J Biol Regul Homeost Agents,2014,28(2):225-236.