麥長管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段克隆及吡蟲啉脅迫對其表達的影響

白微微 高海峰 張航 楊安沛 李廣闊

（新疆農業科學院植物保護研究所 農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091）

麥長管蚜Sitobion avenae（Fabricius）是新疆麥區的常發性害蟲，長期以來主要使用化學殺蟲劑進行防治，隨著防治次數和用藥量的不斷上升，麥長管蚜對殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性［1］。昆蟲對殺蟲劑產生抗性的原因之一是體內解毒酶活性提高，昆蟲解毒能力增強［2］。羧酸酯酶是昆蟲解毒酶系之一，在昆蟲頭部、中腸、馬氏管等組織中均有存在，參與激素代謝，神經遞質降解及農藥解毒等［3-4］。隨著昆蟲抗藥性研究的不斷深入［5］，現已闡明解毒酶參與昆蟲抗藥性分子機制主要包括基因增強表達與基因內部氨基酸突變兩部分［6］。有研究證明棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hübner）羧酸酯酶的mRNA過量表達對擬除蟲菊酯的抗性起重要作用［7］；Demaeght［8］等發現二斑葉螨 Tetranychus urticae（Koch）抗螺螨酯品系中一個酯酶基因和兩個細胞色素P450氧化酶基因的相對表達量升高；致倦庫蚊Culex quinquefasciatus中有機磷類殺蟲劑抗性品系的酯酶基因拷貝數量較之敏感品系多達250倍［9］；通過RNAi技術證實羧酸酯酶基因參與飛蝗Locusta migratoria manilensis對馬拉硫磷等殺蟲劑的解毒過程［10-11］，這些結果均顯示昆蟲酯酶在解毒代謝與抗藥性中的重要作用。

吡蟲啉是蚜蟲防治中廣泛使用的殺蟲劑，具有高效、低毒，與常用殺蟲劑無交互抗性的特點，對麥長管蚜有良好防治效果［12］。然而由于吡蟲啉長期、頻繁的使用，其抗性問題日益引起關注。目前，吡蟲啉對麥長管蚜解毒酶基因分子機理層面的影響還尚未明確。結合昆蟲解毒酶基因與抗藥性的相關研究報道，本研究通過克隆得到羧酸酯酶基因序列，利用實時熒光定量PCR對吡蟲啉脅迫下的麥長管蚜羧酸酯酶基因表達進行了初步探索，旨在研究吡蟲啉對麥長管蚜羧酸酯酶基因表達的影響，揭示羧酸酯酶基因在麥長管蚜解毒代謝中發揮的作用，為開展麥長管蚜抗性分子機制研究奠定一定基礎，同時該研究對于延長現有殺蟲劑使用壽命，降低防治成本也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：麥長管蚜采自新疆昌吉軍戶農場，室內用新鮮麥苗飼養繁殖。飼養條件為：溫度（23± 1）℃，光周期14：10（L：D），相對濕度RH 60%-70%。選取大小基本一致的健康無翅成蚜個體為實驗材料。

主要試劑：97.4%吡蟲啉原藥為江蘇揚農化工生產；TRNzol Reagent（Total RNA提取試劑）為Invitrogen公司產品，FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、PCR Master Mix、PCR產物純化試劑盒、SuperReal PreMix（SYBR Green）均為北京天根生化公司產品，pMD 19-T Vector Cloning Kit為Promega公司產品。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定及不同濃度吡蟲啉對麥長管蚜的處理 吡蟲啉毒力測定及后續處理均采用帶蟲浸葉法，將吡蟲啉原藥用丙酮稀釋為母液，配制成不同濃度梯度，將麥長管蚜試蟲連帶小麥葉片浸入吡蟲啉藥液中10 s后取出放于濾紙上晾干，置于放有濾紙的圓形塑料培養皿中，用紗布覆口后將培養皿放于麥長管蚜常規培養箱中，對照試蟲使用丙酮處理，24 h后檢查并統計蚜蟲死亡率（輕觸蟲體時不動計為死亡），對照死亡率小于10%數據可用。每處理均為3次重復，每重復45-60頭蚜蟲，利用SPSS 19.0計算毒力回歸方程、LC50及95%置信區間。根據毒力測定結果，用吡蟲啉LC5、LC15、LC30、LC50和LC80將室內飼養的無翅成蚜按照毒力測定方法處理，24 h后挑取存活成蚜置于-80℃儲存備用。

1.2.2 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 取40頭蚜蟲于1.5 mL Eppendorf管中低溫勻漿，用TRNzol Reagent 進行總RNA提取后溶于DEPC水，電泳檢測核酸質量并測濃度。按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒的試劑說明書合成第一鏈cDNA，合成cDNA產物置于-20℃儲存備用。

1.2.3 麥長管蚜羧酸酯酶基因克隆及序列分析 利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1）。以反轉錄的第一鏈cDNA為模板，克隆麥長管蚜羧酸酯酶基因。PCR 擴增體系（50 μL）：0.25 μL Ex Taq（5 U/μL），10 μL Ex Taq Buffer，4 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），cDNA 模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各 0.5 μL，加入 RNase-free water 補足至 50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35循環；72℃終延伸10 min。擴增完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將目標產物使用OMEGA的Gel Extraction試劑盒割膠純化。將純化后產物與pMD19-T vector連接轉化至JM 109感受態細胞中，菌落PCR檢測后挑選陽性克隆測序。測序結果及后續分析利用NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 DNAMAN 8、ExPASy、MAGA 7.0、GeneDoc等軟件進行。

表1 實驗引物序列

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 采用qRTPCR分析麥長管蚜羧酸酯酶基因在不同吡蟲啉處理濃度下的表達差異，對照為使用丙酮處理后相同條件下飼養的試蟲。內參基因Actin［13］，所用引物見表1，qRT-PCR 擴增體系（20 μL）：8 μL RealMaster Mix，9.8μLRNase-free water，20×SYBR Solution 1 μL，cDNA模板（500 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.1 μL。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。熒光信號采集自動完成，溶解曲線根據熒光定量PCR儀程序進行，每樣品3個生物學重復。不同濃度吡蟲啉處理下的羧酸酯酶基因相對表達量采用 2-ΔΔCt［14］計算，采用 GraphPad軟件對數據多重比較及差異顯著性分析，數值均以平均值±SE進行表示。

2 結果

2.1 毒力測定

通過毒力測定結果計算吡蟲啉對小麥長管蚜的致死中濃度LC50為13.038 mg/L（95%置信區間為11.951-14.917 mg/L），毒力回歸方程為y=-1.148+1.030 x，根據毒力回歸方程計算吡蟲啉對麥長管蚜的 LC5、LC15、LC30和 LC80值分別為 0.329、1.284、4.035和85.636 mg/L。

圖1 麥長管蚜羧酸酯酶SaEST 3（GenBank登錄號：KY 441614）推導的氨基酸序列與其他昆蟲羧酸酯酶的相似性比較

2.2 羧酸酯酶基因片段的克隆及序列分析

以麥長管蚜cDNA為模板，PCR擴增得到一條約390 bp大小的清晰條帶，與預測片段大小基本一致。純化后連接至pMD 19-T vector中，選取陽性克隆進行序列測定，該序列長度為392 bp，編碼130個氨基酸，推導的蛋白質分子量為14 kD，等電點為4.93。將其推導的氨基酸序列與其它昆蟲進行序列多重比對，結果（圖1）顯示其與豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum（GenBank登錄號：XP 003248391）、麥雙尾蚜Diuraphis noxia（GenBank登錄號：XP 015367392）、夾竹桃蚜 Aphis nerii（GenBank登錄號：AAF 89552）、桃蚜Myzus persicae（GenBank登錄號：P 35502）的酯酶氨基酸序列相似性較高，分別達94%、85%、80%和80%。通過 NCBI 網站Conserved Domain Database保守結構預測（圖2）表明，該基因蛋白質序列1-129位均包含在酯酶家族的保守結構域內，屬于β酯酶亞族。綜合以上結果推測所得片段為麥長管蚜羧酸酯酶基因部分片段，將其命名為SaEST 3，GenBank登錄號KY 441614。為進一步明確麥長管SaEST 3進化過程，對和麥長管蚜SaEST 3氨基酸序列相似性較高的昆蟲在MEGA 7.0中以N-J算法（Bootstrap 1 000）進行了系統進化樹構建（圖3），發現SaEST 3與豌豆長管蚜的酯酶親緣關系最近。

2.3 羧酸酯酶基因的誘導表達

為研究吡蟲啉對麥長管蚜羧酸酯酶基因的影響，使用不同濃度吡蟲啉（LC5、LC15、LC30、LC50和LC80）處理無翅成蚜24 h后，采用2-ΔΔCt法對羧酸酯酶基因SaEST 3的mRNA相對表達進行處理分析，其中對照組羧酸酯酶基因相對表達量為1。結果（圖4）表明吡蟲啉對羧酸酯酶基因SaEST 3的表達有一定影響，LC5、LC50、LC80處理下SaEST 3基因相對表達量均達到1.5以上。從LC5到LC80，隨著吡蟲啉處理濃度增加，SaEST 3基因的轉錄水平有不同程度的增加，其中吡蟲啉LC5處理對羧酸酯酶SaEST 3 mRNA表達的所產生的誘導影響較其它亞致死劑量高，與LC15和LC30的差異顯著（P＜0.05），與LC50差異不顯著（P＞0.05）。LC80處理后麥長管蚜在吡蟲啉脅迫下羧酸酯酶SaEST 3 mRNA表達水平升高，與LC15和LC30相比較差異顯著（P＜0.05），與LC5和LC50相比則未達到差異顯著性水平（P＞0.05）。

圖2 麥長管蚜羧酸酯酶核酸序列及推導的氨基酸序列

圖3 麥長管蚜與其它相關物種羧酸酯酶氨基酸的系統進化樹

3 討論

羧酸酯酶廣泛存在與昆蟲體內，其對外源性化合物的水解作用增強是昆蟲對殺蟲劑產生抗性的重要原因之一［15］。目前已通過克隆技術得到多種昆蟲的羧酸酯酶基因序列［16-17］，本研究利用同源克隆方法得到1個麥長管蚜羧酸酯酶基因片段SaEST 3。通過序列比對和生物信息學分析表明SaEST 3與豌豆長管蚜等昆蟲的酯酶有較高相似性，所編碼氨基酸與其他幾種昆蟲酯酶氨基酸序列有較高相似性，定位于酯酶家族的保守區域內，該基因片段為進一步獲得麥長管蚜羧酸酯酶基因全長，了解結構功能具有重要意義。

圖4 不同濃度吡蟲啉處理下麥長管蚜羧酸酯酶基因的表達水平

研究表明羧酸酯酶介導昆蟲對有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類及氯蟲苯甲酰胺類等多種殺蟲劑的抗藥發展［18］。羧酸酯酶主要通過提高對殺蟲劑的解毒代謝能力、阻隔殺蟲劑能力或改變酶對底物親和力發揮致使昆蟲產生抗性的功能［19-20］。用亞致死劑量的氯蟲苯甲酰胺連續處理小菜蛾Plutella xyllostella（Linnaeus）5代后處理組羧酸酯酶活性顯著高于對照組，表明羧酸酯酶可能參與了小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性［21］。解毒酶基因表達量變化跟抗藥性密切相關，昆蟲解毒代謝酶具有可誘導性，根據這一特征可推測其參與殺蟲劑解毒過程的可能性［22］，張建琴等［23］對飛蝗經過溴氰菊酯處理后發現羧酸酯酶基因表現為可誘導表達，說明其可能參與飛蝗對溴氰菊酯的代謝解毒和抗性產生，謝佳燕等［24］研究證明吡蟲啉不同處理劑量和時間可影響麥二叉蚜Schizaphis graminum（Rondani）啟動酯酶蛋白表達，使蟲體內酯酶活性有顯著性差異，黃水金等［5］發現羧酸酯酶基因在抗性斜紋夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）中的轉錄水平與敏感品系相比高達46.85倍，由此推測羧酸酯酶基因轉錄水平升高與斜紋夜蛾對溴氰菊酯的抗藥性密切相關。

昆蟲在藥劑脅迫后可能會刺激體內相應的防御解毒體系來不同程度的降低毒害［25］。本研究結果說明吡蟲啉對麥長管蚜酯酶基因的表達具有一定影響，據此推測該羧酸酯酶基因SaEST 3可能與麥長管蚜對吡蟲啉的解毒代謝有關。羧酸酯酶基因在LC5處理下表達量升高，隨著吡蟲啉劑量增加呈現先降低后增加的表達水平，表明該基因的相對表達水平受藥劑處理濃度的影響，然而對羧酸酯酶基因在吡蟲啉處理下的具體表達模式目前并未明確。因此，為了闡明羧酸酯酶基因在麥長管蚜對殺蟲劑代謝解毒中發揮的作用，今后的研究工作將圍繞羧酸酯酶的序列結構分析和表達模式分析展開，通過對基因結構的進一步探索、轉錄調控及RNA干擾等技術研究羧酸酯酶的結構特征和驗證麥長管蚜羧酸酯酶基因的功能，為探討麥長管蚜的抗性產生及解毒代謝機制奠定基礎。

4 結論

本研究所克隆麥長管蚜羧酸酯酶基因片段大小為392 bp，共編碼130個氨基酸，推導的蛋白質分子量為14 kD，等電點為4.93。序列比對和生物信息學分析顯示該基因片段與其他幾種昆蟲酯酶基因有較高相似性，命名為SaEST 3（GenBank登錄號：KY 441614）。使用熒光定量技術進一步分析了SaEST3在吡蟲啉不同劑量處理下mRNA相對表達水平，結果證明吡蟲啉對麥長管蚜羧酸酯酶基因SaEST3表達有一定影響。

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