產纖維素酶菌株的篩選及離子束誘變

劉婉 趙珊珊 焦湞 楊逢源 王雁萍

（鄭州大學物理工程學院，鄭州 450000）

纖維素是地球上豐富的可再生資源，纖維素類物質的利用對解決全球性的能源危機具有十分重要的意義。我國是個農業大國，秸稈總產量居世界首位，每年產生約8×107t以上秸稈［1］。當前秸稈的利用方式主要有秸稈還田、秸稈作飼料、秸稈栽培食用菌、秸稈作能源和秸稈作工業原料，但是仍然存在秸稈利用率低、秸稈作為能源轉化效率低等問題［2］。

纖維素酶是由多種可降解纖維素生成葡萄糖的水解酶組成的復雜酶系，因此定義為纖維素酶系。根據纖維素酶組分在降解纖維素過程中作用的不同，將纖維素酶分為3類，分別為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶［3］。自然界中存在著大量的能產生纖維素酶的菌株，因此從中篩選產纖維素酶較高的菌株在纖維素的高效利用領域具有十分重要的意義。目前常見的產纖維素酶菌株主要有真菌、細菌和放線菌。由于真菌產纖維素酶具有酶系全，產量高等優點，因此對真菌產纖維素酶的研究最多。但真菌產纖維素酶也存在著培養周期長的缺點，而細菌產纖維素酶的培養周期較短。因此，研究細菌產纖維素酶或者改良細菌產纖維素酶菌株具有十分重要的現實意義。

目前，國內DNS測纖維素酶活法多使用分光光度計來測量吸光值，且反應體系都在試管中進行。測量過程步驟復雜，耗時時間長、粗酶液樣品需求量大，不利于大批量樣品快速檢測酶活。本實驗采用Kim［4］改良后的DNS測酶活法即酶標儀高通量測酶活法，可提高篩選效率，且實驗結果更直觀，將此法應用于離子束誘變初篩實驗中，以期高效快速篩選出高產CMC酶活的突變菌株。

近年來，離子束在改良生物材料方面的應用與發展十分迅速。離子束具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、誘變育種技術穩定可靠、簡便易行、重復性好等優點，且誘變效應是局部、可選擇、可控的［5］。本研究從含腐敗秸稈的土壤中分離纖維素酶產生菌，并采用離子束誘變法輻照出發菌株，以期提高出發菌株產CMC酶活的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 樣品采自含腐敗秸稈的土壤。

1.1.2 培養基 CMC-Na初篩培養基（g/L）：CMCNa 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母粉10.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0；CMCNa生長培養基（g/L）：CMC-Na 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母膏10.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 5.0；產酶培養基（g/L）：CMC-Na 15.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母膏10.0 g/L，pH 5.0。

1.1.3 試劑配制方法 3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）配置方法：酒石酸鉀鈉182.0 g，溶于500 mL蒸餾水中，加熱（不超過50℃），于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3 g、NaOH 21.0 g、苯酚5.0 g、無水亞硫酸鈉5.0 g，攪拌至完全溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，避光室溫保存兩周后使用［6］。

剛果紅試劑：剛果紅1 g/L。亞甲基藍染色劑：亞甲基藍1 g/L。

1.1.4 儀器設備 ZHP-230落地冷凍搖床：常州普天儀器制造公司；YXQ-LS-SOSII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；離心機AllegraTM64R Centrifuge：BECKMAN COULTER；PH計：Seven Excellence，Switzerland；酶標儀VARIOSKAN LUX ：Thwemo。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 將收集到的土樣與無菌水充分混合，過濾去除殘渣。收集樣品過濾后的濾液，取適量濾液上清液進行梯度稀釋，將稀釋液涂在CMCNa初篩培養基上，30℃恒溫培養，出現菌落后反復劃線、純化培養，獲得純菌落。

1.2.2 產纖維素酶菌株的篩選 將純化后的菌落分別點種在CMC-Na初篩培養基上，每個培養基點3個樣，30℃培養3 d，用1 g/L 剛果紅染液染色20 min，棄去染液，加入1 mol/L NaCl 溶液，洗滌5 min后棄去NaCl 溶液，測量菌落直徑和透明圈直徑，分別用D和H來表示。根據透明水解圈直徑和菌落直徑的比值（D/H）大小初步判斷菌株產纖維素酶的能力，選取比值大的菌株進行后續研究。

1.2.3 菌種鑒定 將出發菌株進行分子鑒定，取搖瓶180 r/min，培養3 d的菌液離心，提取DNA。以所提取的DNA為模版，使用細菌的通用引物27F和1492R進行16S rRNA基因的PCR擴增。擴增體系為 50 μL（10×Buffer 5.0 μL，MgCl23.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物各 1.5 μL，Taq 酶 0.4 μL，DNA 模板 1.0μL，ddH2O 33.6 μL）。PCR 條件 ：95℃ 5 min ；94℃40 s，55.3℃ 40 s，72℃ 90 s，72℃ 5 min ；共 32 個循環；72℃ 10 min。PCR 產物測序由武漢華大基因科技公司完成。將測序得到的序列，通過NCBI進行BLAST比對與已知16S rRNA序列進行同源性的比較，并用Mega軟件構建系統發育進化樹。

1.2.4 離子束誘變 將出發菌株在CMC-Na生長培養基上30℃培養2 d。用接種環挑取適當菌體到4mL的誘變保護劑中，并用震蕩器使菌體在誘變保護劑中均勻分布制成菌懸液，然后測量菌懸液的OD600值。適當加入菌體或誘變保護劑使菌懸液的OD600在0.5-0.8之間，以保證輻照過程中，菌體單層平鋪于培養皿中。取50 μL菌懸液在培養皿中央均勻涂布，涂布形成直徑為2 cm的圓形區域，在超凈工作臺中自然晾干。N+注入劑量分別為1×1014N+/cm2、5×1014N+/cm2、1×1015N+/cm2、5×1015N+/cm2、1×1016N+/cm2和5×1016N+/cm2，此誘變劑量的選擇參照離子束誘變細菌的劑量［7］。輻照后在培養皿中加入4 mL無菌水，并用滅菌后的橡膠塊擦拭培養皿底部輻照過的菌斑。最后將菌液倒入含30 mL產酶培養基的錐形瓶中，在37℃，160 r/min條件下搖瓶培養12 h。

1.2.5 誘變致死率與正負突變率的測定方法 將誘變前的菌懸液梯度稀釋涂布于CMC-Na生長培養基上。培養48 h后計數得出誘變前菌液濃度。將誘變過后橡膠塊擦拭完全的菌液震蕩均勻后，稀釋涂布于CMC-Na生長培養基上，培養48 h后計數得出誘變后菌液濃度。在測定正突變率時，將突變菌株中CMC酶活高于出發菌株的突變菌株定義為正突變菌株。

1.2.6 誘變前后菌株的形態特征 用接種環點種出發菌株與突變菌株在CMC-Na生長培養基上30℃培養96 h后，觀察單菌落形態特征。同時用亞甲基藍試劑對菌體進行染色，并在1 000倍顯微鏡下進行鏡檢。

1.2.7 突變菌株的初篩和復篩 初篩：輻照后的菌株在CMC-Na液體產酶培養基中37℃，160 r/min 搖床培養12 h后，稀釋涂布于CMC-Na生長培養基上。30℃培養48 h后，從平板上挑取單菌落進行編號，通過畫線擴大培養。將培養好的菌株用無菌槍頭或牙簽接種至裝有2 mL CMC-Na產酶培養基的試管中。放入37℃，180 r/min的搖床中培養24 h后，酶標儀測其酶活。復篩：將初篩CMC酶活較高的突變菌株挑出，傳代培養5代后。每個突變菌株以5%的接種量，在37℃，180 r/min搖床培養24 h后，測其CMC酶活。

1.2.8 CMC酶活測定法 本實驗所測CMC酶活為內切葡聚糖酶活，CMC酶活測定采用酶標儀高通量測定法。測定樣品如圖1所示。

取待測粗酶液20 μL于96孔板中，加入20 μL 1%的羧甲基纖維素鈉溶液（pH為5.0的磷酸緩沖液配置）。40℃水浴反應30 min，然后加人160 μL DNS試劑，用鋁箔包好96孔板，防止揮發，放入120℃的鼓風干燥箱中烘烤20 min，然后用酶標儀在540 nm波長下測定光吸收值，并從葡萄糖標準曲線上計算得出相對應的葡萄糖含量，進而計算酶活［4］。

圖1 菌株DNS顯色圖

酶活力定義為：在適當的溫度和pH值條件下，每1 min內1 mL酶液水解相應的底物轉化成1 μg還原糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

2 結果

2.1 菌株的篩選與鑒定

從含腐敗秸稈的土壤中分離出7株纖維素酶產生菌，它們的透明圈直徑（D）、菌落直徑（H）、D/H，以及培養24 h后CMC酶活的測定結果，如表1所示。其中S-1的D/H比值為2.33，CMC酶活為6.88 U/mL，S-1表現出較高的產纖維素酶的能力。S-1在初篩培養基上的菌落形態及剛果紅染色后形成的透明圈如圖2所示。

根據出發菌株S-1的16S rRNA的序列，選擇同源性較高的菌株構建系統發育樹如圖3所示。結合理化特征，將菌株S-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表1 篩選菌株的D/H與CMC酶活

圖2 菌株S-1剛果紅染色后形成透明圈圖

圖3 基于16S rRNA序列構建的系統發育樹

2.2 誘變致死率

選擇CMC酶活較高的S-1作為出發菌株，進行離子束誘變，誘變劑量的選擇參照離子束誘變細菌的劑量，離子束誘變在6個不同N+注入劑量下的誘變致死率，見表2。隨著劑量的增加，致死率基本呈升高趨勢。當劑量在（5×1014-5×1015）N+/cm2之間時，誘變致死率基本維持在70%-85%左右，正突變率均在28%以上。在劑量為5×1014N+/cm2時，正突變率最高為44%。在劑量為1×1016N+/cm2與5×1016N+/cm2時，致死率較高，正突變率較低。因此，在篩選突變菌株過程中盡可能多選輻照劑量在（1×1014-1×1016）N+/cm2之間的突變菌株。

表2 出發菌株S-1在不同劑量下的誘變致死率和正突變率

2.3 突變菌株的形態學差距

在離子束誘變后的單菌落傳代培養過程中，發現有部分菌株菌落形態發生變化，如突變菌株308。如圖4所示，出發菌株S-1單菌落呈白色，圓形，中央突起，不透明，突變菌株308單菌落呈乳白色，圓形，表面粗糙，有皺褶，中央突起，邊緣透明。突變菌株308與出發菌株S-1相比形成的單菌落較小。將出發菌株S-1與突變菌株308用亞甲基藍溶液染色后在1 000倍顯微鏡下進行觀察，發現突變菌株308的芽孢形態發生變化。出發菌株S-1的芽孢呈橢圓形，而誘變菌株308的芽孢呈圓形。低能N+注入前后突變菌株形態學差異較大，這種變化表示離子束誘變可能導致出發菌株S-1內部基因序列發生改變。

2.4 突變菌株的篩選與遺傳穩定性驗證

低能N+注入后，挑取400株誘變后菌株，選取酶活較高的15株突變菌株傳代培養5代后，其CMC酶活數據見表3。如表3所示，15株突變菌株的CMC酶活與出發菌株S-1的CMC酶活相比均有升高。其中CMC酶活增長率在1%-25%的有8株菌，CMC酶活增長率在25%-50%的有5株菌，CMC酶活增長率在50%-75%的有1株菌，CMC酶活增長率大于75-1相比，CMC酶活增長極顯著，增長率達到了84.40%。將突變菌株308繼續傳代培養，突變菌株308與出發菌株S-1在第6、8、10代的CMC酶活見圖5。突變菌株308的CMC酶活在第6、8、10代均保持穩定，基本維持在16.0-17.5 U/mL左右。因此，可認為離子束誘變提高解淀粉芽孢桿菌產CMC酶活的能力具有遺傳穩定性。

圖4 離子束誘變前后菌落形態差異

表3 菌株的CMC酶活

3 討論

近年來，通過誘變法提高產纖維素酶菌株產纖維素酶能力的研究取得了較好的進展。埃及科學家El-Ghonemy等［8］采用紫外照射與化學誘變劑的復合誘變方法提高了米曲霉NRRL3484產纖維素酶的能力，所得突變株UNAC4K的濾紙酶活是出發菌的4倍多。Sangwijit等［9］采用低能等離子體誘變解淀粉芽孢桿菌，突變菌株的D/H是出發菌株的2倍，誘變后菌株比出發菌株具有更高的產纖維素酶能力。上述研究表明通過誘變提高菌株產纖維素酶的能力是一種有效的誘變方法。低能離子束具有獨特的質量沉積效應，通過與靶分子或自由基發生反應，參與其分子結構而沉積下來［10］。本研究采用低能N+注入法誘變解淀粉芽孢桿菌S-1，得到比出發菌株S-1的CMC酶活提高84.40%的突變菌株308，表明N+注入法提高菌株的CMC酶活是一種有效的誘變育種手段，菌種性能的改變可能與N+的質量沉積效應等有關。

與傳統的分光光度計測酶活法相比，運用酶標儀高通量測CMC酶活法提高了工作效率，克服初篩過程中樣品量大的問題，也使初篩結果更為直觀。選用CMC酶活作為初篩指標可以更直觀的篩選出產酶較高的突變菌株，使整個篩選體系更簡便，篩選數據具有更高的說服力。

圖5 突變菌株的遺傳穩定性

4 結論

從含腐敗秸稈的土壤中篩選出產纖維素酶較高的菌株S-1，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌。并運用低能N+注入突變菌株S-1，低能N+注入前后部分突變菌株菌落形態變化較大。其中，突變菌株308與出發菌株S-1相比菌落變小。運用酶標儀高通量測酶活法測定突變菌株的CMC酶活作為初篩指標，測定5代后突變菌株的CMC酶活作為復篩指標，最終篩選得到突變菌株308，與出發菌株S-1相比，其CMC酶活增長率達到了84.40%。表明離子束誘變是一種有效的誘變育種手段。

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