多氯聯苯降解菌的篩選、鑒定及其降解特性研究

孫桂婷 陳紅云 趙玲超 胡曉珂 陳營

（1. 煙臺大學生命科學學院，煙臺 264000；2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺 264000；3. 中國農業大學煙臺校區，煙臺 264000）

多氯聯苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）是國際上廣受關注的12種持久性有機污染物之一，因具有耐酸堿性、耐熱性、電絕緣性等特點，曾作為阻燃劑、熱載體、絕緣油等被廣泛應用于生產生活中［1］。據估計，全球多氯聯苯總產量約 1.3×106t［2］，而我國多氯聯苯總產量約 1.0×104t［3］。PCBs的難降解性、生物富集性、高毒性等環境特性使其易在環境和生物體內富集，對環境和人類的健康產生危害［4-5］，對PCBs的降解是當前亟待解決的環境問題。人類在河海交匯處活動頻繁，近年來，許多學者對我國河流入海口和近海水域PCBs污染狀況的研究中均表明，調查中所涉及的近海海域水體都受到不同程度的PCBs污染［6-9］，王泰等［10］指出渤海灣已經受到PCBs的污染。

在我們所了解的范圍內，已報道的PCBs降解菌株大多都是從陸地土壤環境篩選得到的，未發現從河海交匯處篩選得到的降解菌株。主要的好氧降解菌如伯克霍爾德氏菌（Burkholderia xenovorans）LB400、真養產堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）H850、紅球菌（Rhodococcus sp.）RHA1、產堿桿菌（Alcaligenes sp.）JB1等可以有氧降解五氯及五氯以上PCBs，底物譜范圍寬廣，但絕大多數的菌株僅局限于降解低氯取代PCBs，且底物譜范圍較窄［11］。在聯苯降解途徑中，主要的降解產物是氯代苯甲酸，大部分降解菌不能繼續利用氯代苯甲酸，只能依靠存在于被污染土壤中的其他好氧菌通過不同的途徑降解［1］。但少數菌株如木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）IR08、 紅 球 菌（Rhodococcus sp.）RHA1等可以繼續利用氯代苯甲酸為碳源生存，并且目前也發現某些降解菌如假單胞菌（Pseudomonas putida）PRS2000等可以利用一氯聯苯為唯一碳源和能源，并能將一氯聯將其完全礦化［12-14］。因此，本實驗從河海交匯處篩選多氯聯苯降解菌，研究其降解特性和底物譜寬度，以期為生物修復PCBs污染土壤提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集 采樣地點為山東煙臺逛蕩河入海口處（N：37.47°，E：121.47°），采集河海交匯處表層 0-15 cm的土樣。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制 富集培養基為LB液體培養基［15］或加入實驗要求所需相應碳源的無機鹽培養基［16］。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，加去離子水定容至1 000 mL，pH7.0。

LB固體培養基：LB液體培養基中加2%瓊脂。

MM30 液 體 培 養 基：（1）（NH4）2SO41 g、KH2PO43 g、Na2HPO46 g、微量金屬鹽溶液0.5 mL、聯苯200 mg/L，加去離子水定容至1 000 mL，pH 7.1。（2）Mixture 44 ：Na2B4O7·10H2O 17.7 mg、CuSO4·5H2O 39.2 mg、CaCl2·6H2O 20.1 mg、ZnSO4·7H2O 1 095 mg、EDTA 250 mg， 加 去 離子水定容至 100 mL。加入 100-150 μL 濃 H2SO4，防止產生沉淀。（3）微量金屬鹽溶液：EDTA 0.5 g、CaCO31 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 10 g、MnSO4·H2O 10 g、Mixture 44 10 mL，加去離子水定容至100 mL。

MM30固體培養基：MM30液體培養基加2%瓊脂。

以上培養基（不含聯苯）均于121℃、0.1 MPa下滅菌20 min后使用。

1.2.2 降解菌的篩選 稱取5 g土壤樣品加入含200mg/L聯苯的MM30液體培養基中，于30℃、180 r/min的搖床中培養7 d。取100 μL菌液連續梯度稀釋并均勻涂布于含有200 mg/L聯苯的MM30固體培養基。選取不同形態的菌株在含有PCB3的MM30液體培養基中繼續純化培養獲得單一菌株，將該菌株經LB液體培養基培養后取0.75 mL加入等量30%的甘油中，-80℃凍存。

1.2.3 多氯聯苯降解菌的鑒定

1.2.3.1 細胞形態觀察 取對數生長期的菌液用Solarbio革蘭氏染色試劑盒進行革蘭氏染色，并在Leica DM5000B顯微鏡下觀察細胞染色狀態。菌液經戊二醛固定乙醇脫水和冷凍干燥后，進行電鏡掃描。

1.2.3.2 菌種鑒定 MoBio試劑盒提取細菌基因組DNA，并用16S rRNA的通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行 PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托上海英濰捷基商貿有限公司測序，測序結果與GenBank中已收錄的16S rRNA序列進行同源性比對，進行細菌的種屬鑒定。利用MEGA5.1軟件的Neighbor-Joining算法構建進化樹。

1.2.4 影響降解菌生長的不同因素分析

1.2.4.1 pH對降解菌生長的影響 取-80℃凍存的P-6-5菌株接入含15 mg/L聯苯的MM30液體培養基中培養36 h。無菌條件下制備休眠細胞，收集處于對數生長期的大量細胞，7 000 r/min離心10min，棄上清，菌泥用MM30清洗兩次，重懸菌液至OD600nm約為1.0。按10%接種量轉接到pH分別為4、5、6、7、8、9，且含有30 mg/L聯苯的MM30液體培養基中繼續培養，間隔適當時間用PerkinElmer Lambda 365分光光度計測定其在600 nm處吸光度值。

1.2.4.2 鹽度對降解菌生長的影響 休眠細胞制備方法同1.2.4.1，按10%接種量轉接到鹽度分別為0、5、20、35、50和65 g/L且含有30 mg/L聯苯的MM30培養基中繼續培養。測定方法同上。

1.2.4.3 不同誘導劑對降解菌生長的影響 取-80℃凍存的P-6-5菌株分別接入含有25 g/L的LB液體培養基中培養過夜，含15 mg/L聯苯或5 mg/L PCB3的MM30液體培養基中培養36 h。休眠細胞制備方法同1.2.4.1，按10%接種量將經過誘導的菌液轉接到含5 mg/L PCB3的MM30液體培養基中繼續培養。測定方法同上。

1.2.5 菌株降解PCB3的動力學實驗

1.2.5.1 菌株對相同初始濃度PCB3的降解 向MM30培養基中加入適量PCB3溶液，使其濃度為10 mg/L，以PCB208為內標。將OD600nm=1.0的重懸休眠細胞按10%接種量接入含有上述PCB3和PCB208混合物的MM30培養基中。于30℃，180 r/min搖床中培養8、16、24、36、48、72 h后，用已除水的正己烷萃取3次，將萃取液用氮氣吹至500 μL后，利用氣相色譜儀（GC-uECD）檢測PCB3的殘留量，計算得出降解菌對PCB3的降解率。

1.2.5.2 菌株對不同初始濃度PCB3的降解 取適量PCB3溶液加入MM30培養基中，使降解體系中PCB3的終濃度為10、25、50、75和100 mg/L，以PCB208為內標。接種方法、萃取方法同1.2.5.1，取樣時間為48 h。同時用分光光度計測定該菌株生長量（OD600nm表示）。

1.2.6 對氯苯甲酸（4-CBA）的檢測

1.2.6.1 4-CBA標準品的檢測 取適量4-CBA標準品固體溶于丙酮中，使其終濃度為10 mg/L，N2吹干后加入 50 μL 衍生化試劑 BSTFA-TMCS 99∶1，73℃孵育30 min，轉移到內襯管中GC-uECD上樣檢測4-CBA的含量及出峰時間。

1.2.6.2 降解產物中4-CBA的檢測 用已除水的乙酸乙酯萃取反應體系，萃取方法、衍生化方法同上，轉移到內襯管后GC-uECD上樣檢測。

1.2.7 氣相色譜分析條件 多氯聯苯的分析采用HP7890A氣相色譜儀，檢測器為uECD。色譜 柱 為 SPB-5（30 m×0.2 mm×0.2 μm）（Sigma-Aldrich Biotechnology LP）。載氣為高純氮氣。進樣口溫度為250℃，進樣體積為1 μL，無分流進樣。柱箱升溫程序如下：初始溫度為100℃，保持2 min，以15℃/min升至200℃后，以10℃/min升至300℃［17］。具體實驗操作參照Barriault等的實驗規范［18］。

1.2.8 菌株對mix13的降解 將mix13溶于丙酮，每種多氯聯苯的終濃度見表1。取OD600nm=1.0的休眠細胞按5%接種量接入含有mix13的MM30培養基中。30℃，180 r/min的搖床中培養48 h后測定降解率。萃取方法和氣相色譜儀（GC-uECD）檢測方法同1.2.5.1和1.2.7。

表1 mix13各組分及終濃度

2 結果

2.1 多氯聯苯降解菌的篩選與鑒定

從含聯苯的土樣中篩選得到一株多氯聯苯降解菌P-6-5，在含聯苯的MM30 固體平板上，降解菌的菌落較小呈圓形，微黃色，半透明，邊緣整齊，表面光滑。電鏡掃描菌株形態如下圖1-A，革蘭氏染色結果顯示如圖1-B。16S rRNA測序結果經過比對后發現與多種假單胞菌有著高度相似性，菌株P-6-5的系統發育樹如下圖2，可以判斷菌株P-6-5屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

圖1 降解菌P-6-5的電鏡掃描圖（×100k）（A）和革蘭氏染色圖（B）

2.2 pH、鹽度對降解菌生長的影響

pH和鹽度對降解菌生長的影響作用明顯，如圖3，降解菌在pH6-8范圍內都可以生存，在過酸或過堿環境中生長受到抑制。同樣，在一定范圍內，鹽度的增加促進微生物的生長，在pH7，鹽度35時是降解菌的最佳生長條件。

2.3 誘導劑對降解菌生長的影響

菌株經誘導和培養后轉接到以PCB3為唯一碳源的MM30培養基中的生長情況如圖4所示，誘導劑不同，微生物生長情況不同。經過LB培養后轉接到以PCB3為唯一碳源的MM30培養基中的生物量逐漸降低，與之相比，經過BPH和PCB3誘導的降解菌在轉接到PCB3后都可以繼續維持菌株的生長，表現出了明顯的生長優勢。在生長后期，由于碳源的消耗不足以維持大量細胞的生長，降解菌的生長進入衰亡期，微生物的生物量逐漸下降。

圖2 鄰接法構建菌株P-6-5的系統發育樹

圖3 菌株P-6-5在不同pH和不同鹽度中的生長情況

2.4 菌株降解PCB3的動力學實驗

2.4.1 降解菌對PCB3的降解 降解菌對PCB3的降解量及殘留率隨時間變化曲線如圖5所示，PCB3的降解量隨時間的增加而增加，殘留率隨時間的增加而減小，且降解量曲線在降解初期增加較快，48 h后增加幅度趨緩，72 h基本到達降解菌的最大降解率（95.3%）。

2.4.2 PCB3的不同初始濃度對降解的影響 從圖6中可以看出，P-6-5對不同濃度PCB3的降解能力不同，隨著濃度的增加，PCB3的殘留率升高，與之對應的降解菌的吸光度值逐漸下降。在底物濃度為10 mg/L時，底物的殘留率僅為9.4%，此時具有最大吸光度值和最大降解速率1.9 mg/（L·h）。如圖7，底物濃度的增加可以促進降解菌對底物的降解能力，而繼續增加底物濃度，PCB3的降解量逐漸下降，降解菌的生長能力降低。

圖4 不同誘導劑對降解菌生長情況的影響

圖5 菌株P-6-5的殘留率曲線和降解量曲線

圖6 PCB3初始濃度對降解的影響

圖7 菌株P-6-5對不同初始濃度PCB3的降解量

2.5 降解產物的檢測與分析

如圖8、9，PCB3及4-CBA標準品的出峰時間分別為10.90 min和8.85 min，實驗組的出峰時間如圖10，很明顯的出現許多雜峰，并且含有PCB3和4-CBA的出峰時間。

圖8 GC-uECD檢測PCB3標準品的出峰時間

圖9 衍生化4-CBA標準品經GC-uECD檢測的出峰時間

2.6 降解菌對mix13的降解

如表2所示，P-6-5對二氯、三氯、四氯聯苯都存在降解，總體遵循氯取代數量增多，降解率降低的規律。菌株P-6-5的底物適應范圍可以涵蓋至四氯聯苯，底物譜范圍較寬。

圖10 PCB3代謝產物經TMS衍生化后的GC-uECD檢測總離子色譜圖

表2 菌株P-6-5對mix13的降解率

3 討論

每種微生物的生長都有其最適pH和鹽度，pH和鹽度的改變會影響酶的活性，進而影響微生物對營養物質的利用，過酸或過堿會造成蛋白變性，細胞膜損壞，進而導致細胞死亡，影響微生物的生長速率［19-20］。結合菌株從河海交匯處篩選得到，海水的平均鹽度為35，pH值范圍7.86-8.30［21］，而在pH7-8，鹽度35時，降解菌P-6-5生長狀況良好，可以判斷P-6-5具備海水菌的特點，這也為海洋PCBs污染修復提供良好開端。

聯苯和多氯聯苯被認為是有助于PCBs生物降解的誘導劑，以BPH和PCB3為碳源的誘導對多氯聯苯降解菌的生長具有明顯的促進作用。低濃度時底物的生物毒性效應不明顯，底物降解率低，而隨著底物濃度的增加可以提高底物被微生物利用的幾率，降解相關的酶與底物結合能力增強，酶促反應效率提高，底物降解量提高。而濃度的提高對降解菌生物代謝能力的促進作用有限，濃度過高反而會因高濃度底物的毒害作用抑制降解菌的生長以及酶與底物結合能力［22］，影響降解菌對底物的轉化。但菌株P-6-5在高濃度的底物環境中（75 mg/L、100 mg/L），仍具有17%、9.8%的降解率和63.75 μg、49 μg的降解量，說明P-6-5能夠適應高濃度PCB3的毒性環境，具有降解高濃度PCBs的潛能。

產物的鑒定是推測代謝途徑的重要證據，聯苯降解途徑是微生物參與PCBs降解的主要途徑，其主要代謝產物為氯代苯甲酸和4-羥基戊酸［23-24］，大多PCBs降解菌不能繼續礦化氯代苯甲酸，需要其他可降解氯代苯甲酸的好氧菌協同作用才能實現完全礦化［25］。對菌株P-6-5的降解產物分析發現，實驗組不僅出現4-CBA的出峰時間，還有許多雜峰，說明PCB3的降解產物中有4-CBA，更可能是降解菌可以利用4-CBA為碳源生存，產物中出現4-CBA的代謝產物，這為降解菌能夠完全礦化PCB3提供有力證據，也推測了菌株P-6-5的降解途徑可能不同于聯苯降解途徑。

Hickey、Nováková和 Tandlich 等［26-28］研 究 者認為假單胞菌是最有效的多氯聯苯降解菌，多項研究表明，有氧條件下，低氯取代同系物較高氯取代同系物更易發生降解［29-31］。根據氯取代位置的不同，具有對稱結構的多氯聯苯降解反應活性低于非對稱結構多氯聯苯，不同位置氯取代PCBs降解反應活性大小順序為：鄰位＞間位＞對位［32］。在本實驗中，菌株P-6-5的降解并不完全符合上述降解規律，對于最難降解的對位多氯聯苯降解率更高，降解更傾向于對位脫氯，可能存在不同的降解途徑。降解菌對毒性較大的對稱型共平面多氯聯苯，如 2，2’，4，4’-四氯聯苯，2，2’，5，5′-四氯聯苯，2，2’，6，6’-四氯聯苯都存在降解，說明 P-6-5能適應毒性較高的多氯聯苯環境，對鄰、間、對位多氯聯苯均有降解，具有一定降解潛能和研究前景。與其他大部分有氧降解菌類似，對于五氯以上高氯聯苯，P-6-5需要厭氧脫氯和好氧降解共同作用。

4 結論

從河海交匯處土樣中篩選得到一株多氯聯苯降解菌P-6-5，16S rRNA鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其最適生長條件為pH7，鹽度35。降解菌對10-100 mg/L底物具有轉化能力，10 mg/L時具有最大降解速率（1.9 mg/（L·h））和最大降解率（95.3%）。對于毒性較大的 2，2’，4，4’-四氯聯苯，2，2’，5，5’-四氯聯苯，2，2’，6，6’-四氯聯苯等對稱型共平面PCBs表現出明顯的降解效果。結合產物分析，推測降解菌P-6-5可能存在不同的降解途徑，對環境中PCBs的生物修復具有重要意義。

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