機油高效降解菌的篩選鑒定及降解特性的初步研究

黃曼曼 鄧百萬 王夢姣 陳文強 劉開輝 尹璐

（1. 陜西理工大學生物科學與工程學院，漢中 723001；2. 陜西理工大學陜西省食藥用菌工程技術研究中心，漢中 723001；3. 陜西省漢中市公安局，漢中 723000）

隨著機油在工業及日常生活中的廣泛應用，其污染已成為人類越來越重視的問題，機油污染不僅對環境造成極大破壞，也很大程度的對人類健康造成危害［1-2］。而解決機油污染問題研究最多的是通過一系列物理及化學方法，但存在著二次污染、成本較高等諸多問題。隨之興起了一種高效、經濟和生態可承受的綠色清潔技術——生物修復技術，其主要包括3大類，植物修復技術、微生物修復技術及植物與微生物聯合修復技術［3-7］。植物修復技術對機油降解能力強，但植物的生長周期較長，修復效率慢，無法直接快速的分解機油，微生物修復技術不僅能很好的解決此類問題，且存在著廣譜、高效、穩定、適應性強等諸多優點，同時有些菌株能很好的適應強酸強堿等極端環境，這些是植物達不到的，所以利用微生物降解機油已成為機油污染土壤治理及環境保護的研究熱點［8-10］。

自然界中存在著許多能以機油及其產品為碳源和能源的土著微生物，目前已經發現能降解機油的微生物有200多種，其中細菌、放線菌、真菌等微生物均可使機油中的烴類化合物得到降解。降解機油中的烴類化合物的細菌主要有：嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.）、微桿菌屬（Microbacterium sp.）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）等，其中假單胞菌對于污染土壤中機油中烴類物質降解治理研究較多，它對烷烴及芳香烴類均具有較好的降解作用。降解機油中烴類化合物的放線菌中主要有：分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）、諾卡氏菌屬（Nocardia sp.）、放線菌屬（Actinomycetes sp.）等，其中研究較多的是諾卡氏菌屬。降解機油中烴類化合物的真菌主要有：金色擔子菌（Aureobasidium sp.）、假絲酵母屬（Candida sp.）、紅酵母屬（Rhodotorula sp.）等，其中研究最多的是假絲酵母，因為它營養要求低，生長繁殖快且降解效果顯著［11-15］。通過從自然生態環境或受機油污染的環境中篩選高效機油降解菌，并用于機油污染土壤及廢水的生物處理，已經成為機油污染環境生物處理技術的重要內容之一［16-20］。

本研究以20#機油和真空泵油為唯一碳源，土壤樣品采于漢中某工具廠的污水處理車間內部活性污泥，由于該土壤環境長期受各種機油類物質的污染，大大增加了土壤環境中機油降解菌的存在。從中分離篩選出機油降解菌，利用紫外分光光度儀測定各菌株機油降解率，篩選出機油高效降解菌，經細菌形態學、生理生化及16S rRNA序列分析對機油高效降解菌株進行鑒定，采用紫外分光光度儀和氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）研究菌株降解特性。本研究旨在為機油污染治理及環境生物修復提供新的菌種資源，以期為機油污染土壤的治理及生態修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要培養基及其配置 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，加水定容至1 L，120℃，1×105Pa滅菌30 min。固體培養基中加瓊脂18.0 g。

MSM培養基（基礎培養基）：硫酸銨2.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，氯化鈉4.0 g，氯化鈣0.02 g，微量元素母液1.0 mL，加水定容至1 L，120℃，1×105Pa滅菌30 min，固體培養基中加瓊脂18.0 g。微量元素母液配置：水100.0 mL，氯化鐵1.2 g，氯化銅0.3 g，氯化鋅0.3 g，氯化鈷0.1 g，硫酸錳0.3 g，鉬酸銨0.1 g。本試驗用機油：等體積20#機油和真空泵油混合。

1.1.2 主要儀器及設備 凈化工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司），電熱恒溫培養箱（DHP-9162，上海慧泰儀器制造有限公司），高壓蒸汽滅菌器（ML-3751L-PC，日本制造），電熱恒溫干燥箱（101-1AS），K960熱循環儀（杭州晶格科學儀器有限公司），PCR擴增儀（英國TECHEN），電泳儀（Bio-Rad），移液器（Eppendorf），4802S紫外分光光度計（龍尼科上海儀器有限公司），GC-MS氣質聯用儀（Thermo-H2GAJD，美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 機油高效降解菌株的分離、篩選及鑒定

1.2.1.1 機油高效降解菌株的分離和篩選 將污染樣品接種到含機油1.0 g/L 的MSM液體培養基上，30℃，160 r/min培養7 d，富集培養3次，富集培養后的菌懸液涂布于含機油1.0 g/L 的MSM固體培養基，選擇具有透明圈且形狀不同的菌株多次在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線，純化培養，將純化后菌株重新轉接到含機油1.0 g/L 的MSM液體培養基中，將能使培養基變混濁的菌株進行甘油保藏。

將初步篩選出能以機油為唯一碳源生長的機油降解菌進行機油高效降解菌的復篩。采用紫外分光光度法測定機油的含量［21-22］，挑取純化后的菌株轉接入含機油2.0 g/L的100 mL MSM液體培養基中，30℃，160 r/min培養7 d，以石油醚萃取并定容置50 mL容量瓶［23-24］。經預實驗結果，在紫外分光光度計235 nm處測其吸光度。機油降解率的計算公式如下：

其中，A為空白對照品吸光度值，B為樣品吸光度值。

1.2.1.2 機油高效降解菌株的鑒定 形態特征觀察：將純化后的菌株單菌落接種在牛肉膏蛋白胨固體平板上劃線，37℃恒溫培養2 d，期間觀察其生長情況，菌落形態，顯微鏡下觀察菌體形態（包括菌體特殊結構芽孢、鞭毛等），以及革蘭氏染色特性。

生理生化特征分析：利用氧化酶活性、吲哚試驗、甲基紅反應、乙酰甲基甲醇試驗、糖類發酵試驗、接觸酶試驗、硫化氫產生試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗等實驗對菌株進行生理生化特性分析［9，25-26］。

16S rRNA基因序列分析：菌株DNA提取參見細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）。

采用細菌 16S rRNA 通用引物 27F ：5′ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和 1492R ：5′ -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′對所提DNA進行16S rRNA擴增。PCR反應體系50 μL：2 × Taq Master Mix 0.25 μL，上下引物（10 μmol/L）各 2 μL，模板DNA 1 μL（ 濃 度 10 ng/μL），10 × Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 5 μL，dd H2O 補齊至 50 μL。反應條件：94℃預變性 2 min；94℃ 30 s，55℃退火 30 s，72℃1 min，32個循環；72℃延伸2 min，4℃ 保存。PCR產物電泳檢測后送上海生工生物技術有限公司進行正、反雙向測序，再于NCBI進行序列比對，確定屬種，并獲取GenBank號。利用MEGA 6.0，按照鄰接法（Neighbor-joining）法聚類，選擇1 000個重復做Bootstrap值分析，構建系統發育樹。

1.2.2 機油高效降解菌株降解特性的研究

1.2.2.1 培養時間對菌株機油降解率的影響 將待測菌株分別接種至pH為7.4含機油2.0 g/L的MSM液體培養基中，在30℃，轉速160 r/min的恒溫振蕩器中分別培養1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d，定時取樣，測定機油的殘留濃度，觀察不同培養時間下不同菌株機油降解率。

1.2.2.2 溫度對菌株機油降解率的影響 將待測菌株接種至初始pH為7.4的機油濃度為2.0 g/L的液體MSM培養基中，分別置于20、25、28、30、35和40℃恒溫振蕩器中，以轉速160 r/min避光振蕩培養7 d，定時取樣，測定機油的殘留濃度，觀察不同溫度下不同菌株的機油降解率［25］。

1.2.2.3 pH對菌株機油降解率的影響 待測菌株接種至用1 mol/L的HCl或NaOH調好pH（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）的機油濃度為2.0 g/L的液體MSM培養基中，在30℃下以轉速160 r/min避光振蕩培養7 d，定時取樣，測定機油的殘留濃度，觀察不同pH下不同菌株的機油降解率［26］。

1.2.2.4 機油高效降解菌株在不同機油組分中的生長特性 將待測菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基，于30℃，160 r/min振蕩培養2 d，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，用生理鹽水沖洗兩遍后加入100 μL無菌水重懸，分別接種于單一組分的十二烷、十六烷、十八烷、二十二烷、苯、萘、芘和菲為唯一碳源的MSM培養基中，30℃，160 r/min培養5 d，取樣稀釋、涂平板計數，計算在不同機油組分中細菌生長數，每組3個平行，并作不加任何機油組分的MSM培養基培養細菌的空白對照。

1.2.2.5 機油高效降解菌株降解特性研究 用GC-MS方法分析降解機油的殘油組分。先用正己烷萃取和溶解降解后殘油組分，萃取方法與1.2.1利用石油醚萃取機油的方法相同。用頂空進樣器進樣，DB-5MS毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫50℃，維持3 min后以15℃/min的速率升到120℃，再以8℃/min升溫速率升到260℃，然后在該溫度保持25 min，載氣氦氣，柱流量1 mL/min，分流比10∶1，進樣口溫度250℃，傳輸線溫度260℃，離子源溫度250℃，EI源，電離電壓70 eV，掃描范圍35-650 amu［27-30］。

2 結果

2.1 機油高效降解菌株的分離、篩選

分離出54株均能以機油為唯一碳源生長，編號JZ1-JZ54，篩選出其中降解圈較明顯且菌落形態不同的22株菌株。對初篩的22個菌株進行機油降解能力的復篩，計算各菌株的機油降解率，結果見表1。由表1可見，初篩的22個菌株都對機油具有一定的降解作用，但不同菌株對機油的降解能力明顯不同，降解率最高的達到42.62%，最低的只有5.52%。其中JZ6、JZ18、JZ41和JZ50這4株菌的機油降解率超過30%，并且由多重比較結果可見，菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50與其他菌株的機油降解率具有極顯著差異（P＜0.01），因此選取這4株機油高效降解菌株做進一步鑒定。

表1 各菌株機油降解率的差異顯著性檢

2.2 機油高效降解菌株鑒定

2.2.1 機油高效降解菌的形態特征觀察 對機油高效降解菌株進行形態特征觀察（圖1），4株菌株的菌落顏色，形態，菌體形態等都存在差異。其中JZ6菌落顏色為淡橘黃色，菌體形態呈球形，有芽孢，著生于細胞中央，無鞭毛，JZ18菌落顏色為淡黃色，菌體形態呈鏈狀，無芽孢，極生鞭毛。JZ41菌落顏色為白色，菌體形態呈桿狀，有芽孢，著生于細胞末端，周生鞭毛。JZ50菌落顏色為白色，菌體形態呈鏈狀，無芽孢，極生鞭毛，4株菌株均為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株菌落形態及革蘭氏染色

表2 菌株生理生化特征

2.2.2 機油高效降解菌的生理生化特征分析 機油高效降解菌株菌株生理生化試驗結果，見表2。

2.2.3 機油高效降解菌的16S rRNA基因測定 對機油高效降解菌進行16S rRNA基因測定，序列分析表明，JZ6與Massilia sp.菌屬序列相似性為97%，JZ18與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）序列相似性為99%，JZ41與鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）序列相似性為98%，JZ50與Shinella zoogloeoides sp.菌屬序列相似性為98%。4株機油高效降解菌與親緣相近菌株 16S rRNA 序列的系統發育樹，如圖2。

結合4株菌的形態學特征及生理生化試驗，初 步 確 定JZ6為Massilia sp.菌 屬，GenBank號為KY996847，JZ18為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），GenBank號為KY996857，JZ41為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.），GenBank號 為 996866，JZ50為Shinella zoogloeoides sp.菌屬，GenBank號為996862。

圖2 4株機油降解菌與親緣相近菌株16 S rRNA序列的系統發育樹

2.3 機油高效降解菌株降解特性的研究

2.3.1 培養時間對菌株機油降解力的影響 測定培養時間對菌株機油降解力的影響，結果見圖3。在培養第9天時，菌株JZ6、JZ18，JZ41和JZ50機油降解率分別達到44.50%、34.57%，35.33%和40.20%。菌株JZ6，JZ50在1-5 d機油降解率增長較快，第5天后，機油降率增長較平緩，處于較穩定狀態，菌株JZ18，JZ41在第7天機油降率增長較平緩，處于較穩定狀態。該結果表明不同菌株最佳降解時間不一致，菌株培養時間要控制在一定范圍（5-7 d），菌株機油降解率不僅能夠達到最好效果，且株菌投入生產時，時間短，效益高。

圖3 培養時間對菌株機油降解率的影響

圖4 培養溫度對菌株機油降解率的影響

2.3.2 培養溫度對菌株機油降解率的影響 測定培養溫度對菌株機油降解力的影響，結果見圖4。菌株JZ6在培養溫度為35℃時，機油降解率達到最高43.01%，菌株JZ18，JZ41和JZ50在培養溫度為30℃時，菌株機油降解率達到最高，分別為32.74%、32.48%和38.94%。該結果表明菌株培養溫度要控制在一定范圍內（30-35℃），機油降解率才能達到最好效果。并且由于土樣最初富集培養的溫度為30℃，所以4株菌株在30℃時都有較好的機油降解效果。

2.3.3 pH對菌株機油降解率的影響 測定培養基初始pH對菌株機油降解率的影響，結果見圖5。菌株JZ6、JZ18、JZ50的機油降解率在培養基初始pH 7.5時達到最大，分別為42.12%，34.73%，41.18%，菌株JZ41機油降解率在pH 7時達到最大值34.04，此外偏弱酸性或弱堿性的環境均不利于菌株的機油降解，要控制培養基的初始pH在7.0-7.5之間。

圖5 pH對菌株機油降解率的影響

2.4 菌株在不同石油組分中的生長特性

菌株在不同機油組分中的生長特性結果，見表3，4株菌株均能以十二烷、十六烷、十八烷及苯和萘為唯一碳源的培養基中生長，JZ6和JZ50還能在以芘和菲為唯一碳源的培養基中生長。

表3 菌株在不同機油組分中的生長

2.5 機油高效降解菌株降解特性

研究機油高效降解菌株對機油具體組分的降解，菌株接種于機油濃度為2.0 g/L的MSM培養基，振蕩培養7 d，用正己烷萃取并溶解培養液中的機油殘油組分進行GC-MS分析，結果見圖6。GC-MS分析機油殘油組分，發現機油主要組分為直鏈烷烴；其次為支鏈烷烴和環烷烴，以及一定量的芳香烴和非烴類物質，其中的直鏈烷烴主要為正十二烷、十四烷、十五烷、二十烷、二十四烷、二十七烷、二十八烷及三十六烷，烷烴占原油總量59.89%.菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50對總烷烴的降解率分別達到68.66%、52.69%、49.37%和61.40%，對直鏈烷烴的降解率分別為86.89%、55.98%、58.42%和89.13%，表明4株菌對烷烴具有很強的降解效果，對直鏈烷烴的降解作用尤為明顯，對于中鏈、C16-C28長鏈烷烴都有較顯著地降解作用，菌株JZ6和JZ50對除烷烴類的其他芳香烴類物質也有一定的降解作用。

3 討論

隨著石油開采及石油工業的發展，石油污染問題日趨嚴重，而機油作為石油非常重要的一個餾分，在機械制造、維修等行業被廣泛應用，產生的大量含油廢水不僅污染環境，同時也給人類及其他生物帶來很大的危害。分離、馴化出高效的機油降解菌成為機油污染環境生物修復的一個重要的研究方向。目前，對于石油降解菌的研究較多，而對于機油降解菌的研究較少。Quatrini等［31］從機油污染地區中分離出幾株能對十二烷、十五烷和十六烷等烷烴類物質具有很好的降解作用的紅球菌屬，但不能降解芳香烴類物質。Soudi等［32］從機油污染地區分離出一株對苯酚有很強的降解能力的菌株SKO-1，在含苯酚1.0 g/L的培養基中培養2 d后對苯酚降解率為99%以上，但對中長鏈烷烴及其他的芳香烴類物質的降解能力不明顯。孫華慶等［33］從首鋼焦化廠的污水處理系統中分離1株能降解吡啶的菌株BC026，經鑒定為Shinella zoogloeoides菌屬，當吡啶濃度為1 800 mg/L，投菌量為0.06 g/L時，BC026可在46 h內將吡啶完全降解。蘇瑩等［34］從山東勝利油田的機油污染水體中分離出10株降解機油的細菌，培養6 d后，其中最高機油降解率為54.74%，其余菌株均在40%以下。本研究所獲得的4株機油高效降解菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50分別屬于Massilia sp.、Pseudomona sp.、Sphingobacterium sp.和 Shinella sp.，有 關Pseudomona sp. 屬的降解菌中，Lin等［35］對菌株 Pseudomona sp. P29 的研究結果表明，菌株P29對短鏈烷烴有較好的降解效果，而本研究所篩選菌株JZ18對長鏈烷烴也有很好的降解效果。與孫華慶等［33］研究結果相比，本研究所篩得的菌株JZ50除能降解吡啶外，還能以十二烷、十六烷、十八烷、芘，菲及苯和萘為唯一碳源生長。有關Massilia sp.屬的降解菌中，羅小艷等［25］對多環芳烴中菲具有很好的降解作用，48 h菲的降解率迗96.78%，而本研究所篩選菌株JZ6對多環芳烴中芘，菲，苯和萘都具有一定降解作用。

圖6 菌株降解機油的GC-MS分析

4 結論

從長期受機油污染地區分離篩選出4株機油高效降解菌株，經鑒定4株菌株分別為Massilia sp.、Pseudomona sp.、Sphingobacterium sp.和 Shinella zoogloeoides sp.，在含機油培養基中30℃培養7 d后，機油降解率分別為42.62%、33.67%、33.36%和40.52%。在溫度20-40℃，pH5-9條件下菌株都具有降解機油的能力，4株菌株均能以十二烷、十六烷、十八烷及苯和萘為唯一碳源生長。GC-MS分析發現4株菌株對總烷烴的降解率分別達到68.66%、52.69%、49.37%和61.40%。4株菌株具有較強的機油降解能力，適應能力強，對于利用微生物治理機油污染環境具有潛在的應用前景。

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