紅樹林微生物DH-2胞外蛋白酶的性質及產酶條件優化

徐珊 李任強 鄭振華 張云 孫愛君 胡云峰

（1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室 廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；2. 暨南大學生物工程學系，廣州 510632；3. 日照職業技術學院 海洋工程學院，日照 276826）

蛋白酶是一類能夠催化水解肽鍵的酶，基本可分為酸性、中性、堿性蛋白酶3種，廣泛應用于工業生產，如醫藥、皮革、食品加工、飼料、洗滌劑等多個生產領域［1-4］，其來源廣泛，主要存在于動物內臟、植物莖葉及果實和微生物中［5］。相比較于利用動植物生產蛋白酶，微生物生產蛋白酶具有高產菌株選育簡單快速，培養條件簡單易擴大培養，生產周期短，且產出的蛋白酶多為胞外酶，分離純化簡單經濟，是工業蛋白酶的重要來源［6］。

海洋是生命的起源地，不僅面積廣闊，而且蘊藏著極為豐富的微生物資源。在海沉積環境、紅樹林以及深海熱液噴口、冷泉口等，都發現了新穎微生物的存在［7］。利用豐富的海洋資源，從種類繁多的海洋微生物中分離純化出生物酶制劑，已經成為國內外酶制劑研究領域的發展方向和研究熱點［8］。目前已分離得到的海洋微生物酶有：蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、DNA聚合酶和溶菌酶等［9］。且由于海洋特殊的極端環境，與陸地微生物產的蛋白酶相比較，海洋來源的酶通常具有耐鹽、耐堿、耐熱和耐低溫等優良特性。

從大亞灣紅樹林土壤樣品中篩選出一株產蛋白酶菌株，鑒定該蛋白酶粗酶液的酶學性質，并對該菌株的產酶條件進行優化，以期獲得優良性能的海洋微生物蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大亞灣紅樹林根際土壤分離得到產蛋白酶菌株DH-2。

1.1.2 培養基 脫脂奶粉培養基：配置1%瓊脂糖、1%脫脂奶粉溶液，高壓滅菌待冷卻到合適溫度后倒平板。種子培養基（1 L）：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g。基礎發酵培養基（1 L）：可溶性淀粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.5 g，pH 為 7.0。

1.1.3 試劑 實驗所用試劑皆為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 產蛋白酶菌株初篩［10］在無菌操作環境下，取一定量土壤于試管中，加入10 mL無菌水，在37℃，150 r/min條件下震蕩1 h，靜置一定時間后，取上清液1 mL，依次梯度稀釋成10-1、10-2和10-3，取200 μL各梯度的稀釋樣品，分別涂布于脫脂奶粉培養基平板上，每個梯度設置3個平行組，于37℃培養箱培養24 h，觀察平板長出的菌落以及其周圍形成的透明圈大小。選取菌落周圍具有明顯蛋白水解圈的菌株于平板進行3次以上畫線純化培養，直至純化后保菌。

1.2.2 產蛋白酶菌株復篩 挑選平板上水解圈較大的菌株接入種子培養基，200 r/min，37℃培養24 h。然后按照1%的接種量，將擴大培養后的菌液接種到發酵培養基，200 r/min，37℃培養24 h，發酵液12 000 r/min離心制得粗酶液，測定其酶活，選取酶活最高的菌株進行后續的研究。

1.2.3 酶活測定 采用國標 GB /T23527-2009 規定的福林酚顯色法測定蛋白酶活［11］。酶活定義：40℃，pH7.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量即為1個蛋白酶活力單位［12］

1.2.4 菌株16S rRNA序列測定 采用16S rRNA通用 引 物 27F ：5′-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3′；和1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對 其 進 行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃預變性10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，循環 30 次；72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，進行檢測，然后送至生工生物工程有限公司進行測序。測序結果利用BLAST獲 得 相近的菌株 16S rRNA 序列，然后利用Mega 5.0構建菌株的系統發育樹。

1.2.5 DH-2菌株生長曲線測定 1%的接種量于發酵培養基，200 r/min，37℃培養，每隔2 h測定其生物量 OD600。

1.2.6 粗酶液酶學性質的測定

1.2.6.1 蛋白酶的最適反應pH和pH穩定性 發酵粗酶液經過高速離心后稀釋一定倍數，在不同pH（5、6、7、8、9和10）條件下測定其酶活，粗酶液在不同pH（3-10）下置于4℃冰箱12 h，測定殘余酶活，檢測其pH穩定性。

1.2.6.2 蛋白酶的最適反應溫度和熱穩定性 發酵粗酶液在高速離心后稀釋一定倍數，在不同溫度（40-75℃）水浴條件下測定其酶活，以確定其最適反應溫度。粗酶液在（25-60℃）條件下水浴處理1 h，然后測定其剩余酶活，查看粗酶液的熱穩定性。

1.2.6.3 金屬離子、有機溶劑和表面活性劑對蛋白酶酶活的影響 將稀釋后的粗酶液與不同金屬離子 混 合（Na+、Li+、K+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Cu2+和 Mn2+），使其終濃度達到 5 mmol/L；與不同有機溶劑混合（甲醇、乙醇、正丁醇、正庚醇、正癸醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、環己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、甲苯和四氫呋喃），使其終濃度為10%（V/V）；與不同表面活性劑混合（Triton-100、Tween-20、tween-80、SDS、SDBS和三聚磷酸鈉），使其終濃度為0.1%（V/V），對照組加水處理。各組都在室溫下處理2 h，然后在最適條件下測定各組的酶活，考察其對蛋白酶酶活的影響。

1.2.7 菌株發酵培養基的確定 單因素試驗研究不同碳源（葡萄糖、木糖、可容性淀粉、麥芽糖和蔗糖），不同氮源（酵母提取粉、牛肉膏、酵母粉、氯化銨和硫酸銨），不同碳源含量（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%），不同氮源含量（0、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%），不同初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）和不同氯化鈉含量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）對DH-2菌株產蛋白酶的影響。菌株擴大培養后按照1%的接種量，37℃，200 r/min條件下發酵培養24 h，然后測定酶活，以每組中酶活最高的為100%。根據單因素試驗結果設計正交試驗，確定最適發酵培養基。

1.2.8 菌株發酵條件的確定 單因素試驗研究不同發酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84h和96 h），不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%）和不同發酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃和45℃）對DH-2菌株產蛋白酶的影響。根據單因素試驗結果設計正交試驗，確定最適發酵條件。

2 結果

2.1 篩選結果

復篩過程中，得到一株產蛋白酶酶活較高的菌株，其酶活約為30 U/mL，標記為DH-2。

2.2 菌株的系統發育分析

菌株DH-2的16S rRNA與NCBI數據庫上已知的菌株的16S rRNA對比，結果顯示其與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis NJ1的16S rRNA的同源性達到99%。由圖1可知，菌株DH-2與Bacillus subtilis NJ1處在系統發育進化樹的同一分支上。

圖1 基于16S rRNA序列的系統進化樹

2.3 DH-2菌株生長曲線測定

在4-10 h，菌液的OD值隨著時間的增加呈指數增長，10 h進入穩定期，之后逐漸進入衰亡期（圖 2）。

2.4 發酵液中的蛋白酶粗酶液的酶學性質測定

2.4.1 發酵蛋白酶粗酶液的最適反應pH和pH耐受性 由圖3-A可知，該蛋白酶在pH 8.0有最高的催化活性；在pH 6.0-9.0時，相對酶活都保持在80%以上，能夠發揮較大的催化活性；在pH為10.0時，該蛋白酶仍能保持75%的相對酶活。由圖3-B可知，在pH為4-9之間時，該酶較為穩定；pH小于4或大于10時，嚴重失活。

2.4.2 發酵蛋白酶粗酶液的最適反應溫度和熱穩定性 由圖3-C可知，在較低溫度下，蛋白酶隨著溫度的升高酶活逐漸增大，在65℃時達到最大值。當溫度大于65℃后，酶的蛋白結構受到高溫的影響，酶活性有所降低。由圖3-D可知，粗酶液稀釋一定倍數后在不同溫度梯度下水浴處理60 min，然后在最適反應條件下測定其剩余酶活，對照組放置在4℃處理，并以對照組的酶活定義為100%。蛋白酶在25-40℃條件下處理后酶活不受影響，45-50℃處理后仍保持80%以上的催化活性，之后隨著處理溫度的升高，酶活有損失。

圖2 DH-2菌株的生長曲線

圖3 發酵液中蛋白酶粗酶液的酶學性質測定

2.4.3 金屬離子對蛋白酶活性的影響 由表1可知，5 mmol/L的 Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+和 Li+對酶活性具有一定的促進作用，其余金屬離子對該酶的活性影響較小，總體上該蛋白酶對所檢測的金屬離子均有很好的耐受性。

2.4.4 有機溶劑和表面活性劑對蛋白酶活性的影響 由表2可知，該蛋白酶對所檢測的有機溶劑均具有較好的耐受性，蛋白酶活性受有機溶劑的影響較小。由表3可知，該蛋白酶對所檢測的表面活性劑均具有較好的耐受性，其中Tween-80對該酶的活性具有一定的促進作用。

表1 金屬離子對蛋白酶活性的影響

表2 有機溶劑對蛋白酶活性的影響

表3 表面活性劑對蛋白酶活性的影響

2.5 發酵培養基的確定

2.5.1 碳源的確定 碳源不僅供給微生物生長所需的能量，還對微生物的產酶具有誘導或是阻遏作用。因此，我們需要對培養基的碳源進行選擇，從而獲得適合菌株生長和產酶的發酵培養基。由圖4-A可知，菌株在可溶性淀粉作為碳源的發酵液中產蛋白酶情況最好。

2.5.2 氮源的確定 影響蛋白酶產酶的另外一個重要因素是氮源。由圖4-B可知，該菌株選擇性利用有機氮源作為能量物質，幾乎無法利用無機氮源進行生長和生產，其中對胰蛋白胨的利用較為高效，產酶情況最好，因此選擇胰蛋白胨作為氮源。

2.5.3 碳源和氮源含量對發酵產酶的影響 碳源和氮源的含量對菌株發酵液具有一定的影響。因此，在確定最佳碳源和氮源后，分別設計實驗研究其最適濃度。由圖4-C可知，可溶性淀粉含量為0.5%時發酵液有最大酶活，隨著其含量的繼續增大，其酶活先下降后保持不變。由圖4-D可知，高濃度的胰蛋白胨不僅不能促進菌株的產酶，反而對其有抑制作用，因此確定胰蛋白胨含量為1%。

2.5.4 初始pH對發酵產酶的影響 分析圖4-E，菌株在初始pH為5.0-6.0時產酶情況較為穩定，當pH＞6.0或＜5.0時，菌株所產蛋白酶的量顯著下降，由此可知pH過高或過低都不利于菌株的產酶，因此選擇發酵液的初始pH為5.5。

2.5.5 NaCl濃度的確定 由圖4-F可知，在一定濃度范圍內，菌株的產酶情況受NaCl濃度的影響較小，產酶較為穩定，其中當發酵液的NaCl濃度在低于1%左右時對菌株產酶具有較好的促進作用，但當NaCl濃度較高時對菌株的產酶具有抑制作用。

2.5.6 優化培養基的正交試驗結果 采用L9（34）正交試驗研究碳源、氮源、pH值和NaCl這4個因素對DH-2菌株產蛋白酶的影響。由表4可知，DH-2菌株產蛋白酶的最佳發酵培養基組成為可溶性淀粉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，發酵液初始pH 5.5，NaCl 10 g/L。各因素對菌株產酶的影響，由大到小依次為氮源含量、碳源含量、pH值、NaCl濃度。

2.6 發酵條件的確定

2.6.1 不同發酵時間對產酶的影響 根據圖5-A結果，隨著發酵時間的不斷增加，菌株所產蛋白酶的量不斷增加，當發酵時間為36-48 h時，蛋白酶活力基本達到最大值，之后再延長發酵時間，蛋白酶活力呈下降的趨勢。因此，發酵時間選擇36 h。

2.6.2 不同接種量對產酶的影響 圖5-B表明，菌液的接種量對DH-2菌株發酵產酶的影響不大，接種量在6%-8%時菌株產酶情況基本相同，在8%時發酵液酶活有最大值。

2.6.3 不同發酵溫度對產酶的影響 由圖5-C可知，該菌株在較低溫度（低于25℃）下基本不產蛋白酶，隨著溫度的不斷升高，菌株所產蛋白酶活力不斷增大，當發酵溫度為37℃時蛋白酶活力最大。此后隨著溫度的升高，酶活略有下降，但影響很小。

2.6.4 優化發酵條件的正交試驗結果 采用L9（34）正交試驗研究發酵時間、發酵溫度、接種量3個因素對DH-2菌株產蛋白酶的影響。由表5可知，DH-2菌株產蛋白酶的最佳發酵條件為發酵溫度為40℃，發酵時間為36 h，接種量為7%，各因素主次順序為C＞B＞A。該菌株分泌的胞外蛋白酶在最適培養基和反應條件下的酶活為236.30 U/mL，是初篩中表現的酶活的近8倍。

圖4 發酵培養基的優化

表4 發酵培養基優化正交試驗結果

圖5 發酵條件的優化

3 討論

海洋來源微生物所產的酶類通常具有較好的穩定性，適合工業化應用，是當下的一個研究熱點。Chellappan 等［13］從海 洋 微 生 物 Engyodontium album BTMFS10 中分離到產絲氨酸蛋白酶的菌株，該蛋白酶具有良好的熱穩定性，在60℃保存8 h后仍保持80%以上的酶活；并且對大多數有機溶劑、表面活性劑顯示出較好的耐受性。Hames-Kocabas等［14］從土耳其伊茲密爾灣海洋沉積物樣品中分離得到一株產蛋白酶的放射菌MA1-1，該蛋白酶在pH（8.0-13.0）和較高溫度（35-50℃）條件下具有較好的酶活性。Amoozegar等［15］從NaCl含量為17%的湖水中篩選得到鹽弧菌AF-2004菌株，它產生的蛋白酶具有高耐鹽性，在初始NaCl濃度為10%時產酶效果達到最佳狀態（NaCl濃度為1%）的70%以上，且同時具有較為寬廣的反應pH（5.0-10.0）。這些海洋或者極端環境獲得的蛋白酶都具有良好的耐鹽、耐熱等性能，顯示出較好的穩定性，是許多陸地微生物蛋白酶所不能比擬的。

紅樹林是具有豐富而特殊微生物資源的海洋生態環境，本研究從大亞灣紅樹林樣品中篩選到一株產蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株DH-2，經測定，該蛋白酶的粗酶液表現出良好的耐熱性，并且對多種金屬離子、有機溶劑和表面活性劑中所具有的高耐受性，使其在洗滌業和紡織業等眾多工業應用領域具有很好的應用潛能。由于游離酶本身存在的穩定性差、分離回收困難和難以實現反復連續利用等缺陷，很大程度上限制了其在工業生產中的實際應用，將其制備成固定化酶很有必要［16-18］。本課題后續將對該海洋菌株所產蛋白酶進行分離純化以及固定化制劑研究，以期實現該海洋微生物蛋白酶的產業化制備。

表5 發酵條件優化正交試驗結果

4 結論

從大亞灣紅樹林分離得到的枯草芽孢桿菌菌株DH-2，其最佳發酵條件是1%（m/V，下同）可溶性淀粉，1%胰蛋白胨、1% NaCl，初始發酵pH 5.5，7%的接種量，在40℃培養36 h。在最適條件下，測得發酵液的酶活為236.30 U/mL，約為初篩時的酶活的8倍。該菌株分泌的蛋白酶最適反應pH和溫度分別為8.0和65℃，50℃處理1 h 后，仍保留80%以上的相對酶活。該蛋白酶具有較為寬廣的作用pH，pH在6.0-9.0時能發揮80%以上的相對酶活；作用溫度范圍廣，在40-70℃時，能發揮75%以上的相對酶活。同時，該蛋白酶對多種金屬離子、有機溶劑及表面活性劑均有較好的耐受性。

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