缺血后適應(yīng)對心肌缺血再灌注損傷大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶和血小板-白細胞聚集體表達的影響

孫靜，任法新，孫曉健，張傳煥，李留東，牟楠，董梅

p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的MAPK通路，是重要的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)酶，在心肌缺血再灌注損傷信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用[1]，且p38MAPK與炎性反應(yīng)調(diào)控機制關(guān)系密切[2]。血小板-白細胞聚集體（PLA）是反映體內(nèi)炎癥-血栓狀態(tài)的新指標[3]。本課題組前期已經(jīng)證實高水平的PLA與急性心肌梗死的發(fā)生呈正相關(guān)[4]，且能夠預(yù)測急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后心肌無復(fù)流的發(fā)生[5]。缺血后適應(yīng)是防治心肌缺血再灌注損傷的重要措施，能夠減少心肌缺血再灌注損傷。缺血后適應(yīng)保護機制是否與其調(diào)控PLA表達和p38MAPK信號通路有關(guān)，目前鮮有報道。本研究觀察在心肌缺血再灌注損傷中缺血后適應(yīng)對p38MAPK 蛋白表達及PLA水平的影響，觀察其心肌保護作用機制。

1 材料與方法

材料與試劑：健康雄性SPF級SD大鼠60只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號 11400700221589。體重 200～250 g。p38MAPK 抑制劑SB203580和激活劑Anisomycin購于德國默克公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒和肌鈣蛋白I（TnI）試劑盒購于CUSABIO公司（中國，武漢）。紅細胞裂解液購于美國BD Biosciences公司，CD45和CD41a購于美國eBioscience公司。兔抗小鼠磷酸化p38 MAPK多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，相應(yīng)二抗購自瑞典Amersham公司。

心肌缺血再灌注模型：大鼠以1% 戊巴比妥鈉（0. 23 ml /100 g）行腹腔注射麻醉，頸部正中切口，氣管插管后行機械通氣。分離右側(cè)頸總動脈，將PE-50聚乙烯管插入頸靜脈和頸動脈，手術(shù)穩(wěn)定30 min后，在胸部左側(cè)第4肋間水平打開胸腔， 鈍性分離并剪開心包膜，采用6-0絲線阻斷左前降支（LAD）30 min 再灌注180 min。在再灌注5 min時，通過右頸靜脈根據(jù)分組注射不同藥物。根據(jù)分組給予不同處理。后通過頸動脈插管抽取血3～4 ml，根據(jù)所測指標不同給予不同處理。

實驗分組：完全隨機化方法將實驗大鼠隨機分為6組（每組10只）。假手術(shù)組：開胸，分離左冠狀動脈并穿線，但不結(jié)扎，曠置30 min，缺血25 min時通過右頸靜脈注射10%二甲基亞砜（DMSO）0.8 ml；缺血再灌注（I/R）組：缺血25 min時通過右頸靜脈注射10% DMSO 0.8 ml，缺血結(jié)束后恢復(fù)持續(xù)再灌注3 h；缺血后適應(yīng)組：缺血25 min時通過右頸靜脈注射10% DMSO 0.8 ml，缺血結(jié)束后、再灌注前通過結(jié)夾-松解LAD實現(xiàn)1 min再灌注和1 min缺血反復(fù)3次后，持續(xù)再灌注3 h；SB203580組：缺血25 min時通過右頸靜脈注射SB203580（1 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血結(jié)束后持續(xù)再灌注3 h；Anisomycin+缺血后適應(yīng)（Ani+缺血后適應(yīng)）組：缺血25 min時通過右頸靜脈注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血結(jié)束后再灌注前通過結(jié)夾-松解LAD實現(xiàn)1 min再灌注和1min缺血反復(fù)3次后，持續(xù)再灌注3 h；Ani組：缺血25 min時通過右頸靜脈注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血結(jié)束后持續(xù)再灌注3 h。

心肌損傷標志物的測定：從頸總動脈抽血，3000 g離心15 min后分離上清，留取血清液氮冷凍后-80℃冰箱保存。利用試劑盒測定CK-MB和TnI水平。操作過程嚴格遵循說明書。

心肌梗死面積測定：再灌注3 h取出心臟置于-20℃冰箱約20 min，冷凍后按垂直于左心室長軸方向切片（厚度約2 mm）。將新鮮組織切片置裝有1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（pH 7.4，37℃）中被溫孵15 min。TTC染色后，梗死區(qū)心肌呈現(xiàn)蒼白色，而活性心肌呈現(xiàn)紅色。心肌梗死面積以梗死區(qū)與總左心室體積的比值來表示。

血小板-白細胞聚集體的測定[6]：在基礎(chǔ)狀態(tài)、缺血30 min、再灌注30 min、60 min及3 h后利用流式細胞儀檢測各組PLA水平。取血200 μl，加入檸檬酸鈉抗凝，1000 g離心5 min，棄上清，加入6～10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min，在裂解過程中適當搖動以促進紅細胞裂解，1000 g離心5 min，棄上清，如果發(fā)現(xiàn)裂解不完全，可以重復(fù)上述步驟，加入適量的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，含 135 mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、1.5 mmol/L KH2PO4和 8 mmol/L K2HPO4，pH7.2），重懸沉淀，1000 g離心3 min，棄上清，加入200 μl 的2%多聚甲醛固定60 min，加入1600 μl PBS靜置15min，1500 g離心15 min，PBS重懸3次，最后溶解于200 μl的PBS，每組兩管，均加入CD45，對照組一管加入CD41-PE，另一管加入免疫球蛋白（IgG）設(shè)為同型對照，暗室30 min后離心，PBS懸浮在FC 500 MPC型流式細胞儀上檢測。

蛋白免疫印跡法測定磷酸化p38MAPK水平：再灌注3 h后取出心臟- 80℃冰箱冷凍，提取心肌組織總蛋白，上述蛋白提取液上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，10%分離膠），將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉、 洗脫后分別加入磷酸化p38MAPK多克隆抗體。抗原抗體復(fù)合物用增強化學發(fā)光法（ECL）顯示，暗室 X光膠片曝光，采用Image-ProPlus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值（IOD），IOD=平均光密度值×面積，以靶蛋白IOD值/β-肌動蛋白（actin）IOD值的比值反映靶蛋白相對水平。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用方差分析；均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的CK-MB和TnI水平的比較（表1）

I/R組、缺血后適應(yīng)組、SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組的CK-MB水平（pg/ml）分別為 637.31±43.99、257.38±53.12、307.18±50.56、500.84±52.93和638.34±25.87。I/R組、缺血后適應(yīng)組、SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組TnI水平（pg/ml）分別為 19.67±0.66、10.05±0.81、13.34±0.90、17.32±0.77和19.96±0.72。與I/R組相比，缺血后適應(yīng)組、SB203580組和Ani+缺血后適應(yīng)組的CK-MB和TnI水平明顯降低（P＜0.05）。與缺血后適應(yīng)組相比，SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組的CK-MB和TnI水平明顯升高（P＜0.05），Ani組和I/R組之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組的心肌梗死面積比較（表1、圖1）

I/R組、缺血后適應(yīng)組、SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組梗死面積（%）為40.17±1.77、16.68±2.06、21.38±1.73、27.91±1.79 和40.62±1.59。與I/R組相比，缺血后適應(yīng)組、SB203580組和Ani+缺血后適應(yīng)組梗死面積明顯降低（P＜0.05）。與缺血后適應(yīng)組相比，SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組梗死面積明顯升高（P＜0.05），Ani組和I/R組之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I及梗死面積表達（n=10，±s）

表1 各組大鼠肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I及梗死面積表達（n=10，±s）

注：Ani：Anisomycin。與缺血再灌注組相比 P＜0．05；與缺血后適應(yīng)組相比△P＜0．05

梗死面積(%)假手術(shù)組 166．02±33．26*△ 7．79±0．54*△ 0．00±0．00*△缺血再灌注組 637．31±43．99△ 19．67±0．66△ 40．17±1．77△缺血后適應(yīng)組 257．38±53．12* 10．05±0．81* 16．68±2．06*SB203580 組 307．18±50．56*△ 13．34±0．90*△ 21．38±1．73*△Ani+ 缺血后適應(yīng)組 500．84±52．93*△ 17．32±0．77*△ 27．91±1．79*△Ani組 638．34±25．87△ 19．96±0．72△ 40．62±1．59△組別 肌酸激酶同工酶(pg/ml)肌鈣蛋白I(pg/ml)

圖1 各組大鼠心肌梗死面積的比較

2.3 各組血小板-白細胞聚集體表達的比較（表2）

在基礎(chǔ)狀態(tài)、缺血30 min和再灌注30 min時，I/R組與其他各組比較PLA表達水平無差異（P＞0.05）。在再灌注60 min和3 h時，與I/R組相比，缺血后適應(yīng)組和SB203580組PLA表達水平明顯降低（P＜0.05）。與缺血后適應(yīng)組相比，SB203580組、Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組PLA表達水平明顯升高（P＜0.05）。Ani組與I/R組之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠五個時間點的血漿血小板-白細胞聚集體表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠五個時間點的血漿血小板-白細胞聚集體表達水平比較（±s）

注：Ani：Anisomycin。與缺血再灌注組相比 *P＜0．05；與缺血后適應(yīng)組相比△P＜0．05

假手術(shù)組 (n=10) 7．96±0．30 23．70±2．79*△ 8．99±0．56*△ 8．80±0．36*△ 10．11±0．87*△Ani+ 缺血后適應(yīng)組 (n=10) 9．30±0．29 22．20±2．82 32．69±2．14 45．26±0．94△ 53．85±1．45△

2.4 各組磷酸化p38MAPK的表達水平比較（圖2）

圖2 免疫蛋白印跡法分析各組大鼠心肌磷酸化p38MAPK的表達水平

免疫蛋白印跡法檢測結(jié)果提示，與I/R組相比，缺血后適應(yīng)組、SB203580組和Ani+缺血后適應(yīng)組的磷酸化p38MAPK的表達明顯降低（P＜0.05），Ani組的磷酸化p38MAPK表達水平明顯升高（P＜0.05）。與缺血后適應(yīng)組相比，Ani+缺血后適應(yīng)組和Ani組磷酸化p38MAPK表達水平明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

既往多項研究證實，缺血后適應(yīng)能有效地減輕再灌注損傷，炎癥機制是再灌注損傷的重要機制之一。本實驗通過成功建立大鼠心肌缺血再灌注模型，初步探討缺血后適應(yīng)減少心肌缺血再灌注損傷的機制。實驗結(jié)果提示：（1）心肌缺血再灌注能夠抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化；（2）PLA在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用；（3）通過抑制p38 MAPK磷酸化而減少PLA的表達可能是缺血后適應(yīng)減少缺血再灌注損傷的新機制。

新近研究證實，PLA對于加深對急性心肌梗死發(fā)病機制的認識，指導(dǎo)疾病的診斷和治療，監(jiān)測疾病本身的進展等方面具有重要臨床意義。在臨床上，PLA已經(jīng)成為急性冠狀動脈綜合征治療中的新靶點[7]。血小板和白細胞活化后，其表面的黏附分子增加，黏附分子通過配體相互結(jié)合和（或）通過纖維蛋白原在黏附分子之間的橋接作用形成PLA。研究表明，PLA可以作為評價血小板活化和炎癥反應(yīng)的指標，是與P-選擇素相比，更加敏感的指標[8,9]。炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注過程中的常見表現(xiàn)[10]，可加重心肌損傷，本實驗在缺血再灌注不同時間點觀察PLA表達水平，結(jié)果提示在大鼠心肌缺血30 min的PLA水平較基礎(chǔ)狀態(tài)明顯升高。伴隨再灌注時間從30 min～3 h的不斷延長，PLA表達水平逐漸升高。由此可見，PLA參與了缺血再灌注損傷過程，并發(fā)揮了重要作用。SB203580單獨或聯(lián)合缺血后適應(yīng)能夠顯著地降低PLA水平，提示缺血后適應(yīng)可降低缺血再灌注中的炎癥反應(yīng)，降低PLA水平。

在心肌缺血再灌注時氧自由基和細胞因子的大量釋放激活了p38 MAPK，控制多種轉(zhuǎn)錄因子的表達活性，但它們激活后是帶來了益處還是起到相反的作用尚存在爭論。p38MAPK加劇心肌細胞損傷的相關(guān)研究表明，心肌缺血時，此信號分子主要通過加重炎癥及促進細胞凋亡發(fā)揮作用，心肌再灌注后由于氧自由基的大量釋放、炎性反應(yīng)、代謝紊亂等引起心肌新的損傷。心肌缺血和再灌注導(dǎo)致p38MAPK途徑的激活，此途徑可以使轉(zhuǎn)錄因子和胞質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸化，中性粒細胞和血小板活化增加，加重心肌缺血再灌注損傷。以上提示降低p38MAPK信號途徑活性可緩解缺血再灌注損傷，改善心功能。

本實驗結(jié)果顯示在缺血前，各組大鼠p38MAPK水平較低，且各組差異無統(tǒng)計學意義。再灌注后，I/R組和Ani組 p38MAPK的磷酸化水平升高，且再灌注60 min和3 h時，PLA的表達水平明顯升高，PLA水平越高，梗死面積越大。SB203580單獨或聯(lián)合缺血后適應(yīng)使用均有效地抑制了p38MAPK水平的升高，降低PLA水平。說明SB203580可以模擬缺血后適應(yīng)的心臟保護作用，而p38MAPK激活劑Anisomycin則可部分抵消缺血后適應(yīng)帶來的保護效應(yīng)；如果單純給予Anisomycin而不進行缺血后適應(yīng)干預(yù)，則其損傷作用與I/R組類似。這也從側(cè)面證實了缺血再灌注損傷作為一種應(yīng)激可以激活p38MAPK，進而促進PLA表達水平增加，而缺血后適應(yīng)則可有效抑制這一過程而減輕缺血再灌注損傷。

綜上所述，大鼠心肌缺血再灌注后，PLA表達水平明顯升高，p38MAPK 被磷酸化激活，進一步加重了缺血再灌注損傷。給予缺血后適應(yīng)干預(yù)后，心肌磷酸化p38MAPK蛋白的表達降低、PLA水平明顯減少，有效地保護了缺血再灌注后的心肌組織，其機制可能與抑制p38MAPK磷酸化有關(guān)而減少PLA的表達水平，進而減輕缺血再灌注損傷。

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