經胸肺動脈去神經支配術在肺動脈高壓大鼠模型中的治療作用

黃源，劉一為，項理，邢珺月，蘇展豪，張曉玲，孟健，王佩合，張浩

肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是以平均肺動脈壓力和肺血管阻力不斷升高，肺血管重構為特征的臨床綜合征，持續升高的肺血管壓力及阻力可導致右心后負荷增加，最終導致右心衰竭而死亡[1-5]。PAH的發病機制尚不明確，近年來有研究表明交感神經系統（Sympathetic nervous system,SNS）在肺動脈高壓患者中被激活[6-8]，同時神經激素活化一定程度上促進了肺動脈高壓的病理生理改變[9]。與此同時，有動物研究表明經皮肺動脈交感神經消融術（Percutaneous pulmonary artery denervation，PADN）能消除球囊堵塞左肺動脈遠端導致的肺動脈高壓[10]，同時也有臨床研究表明通過PADN可以降低PAH患者的平均肺動脈壓力及肺血管阻力，提高患者6分鐘步行距離[11,12]。本研究擬通過對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型行經胸肺動脈去神經支配術，探討該手術是否可以降低肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力，并逆轉肺血管重構及右心室肥厚。

1 材料與方法

實驗動物及分組：將24只雄性無特定病原體（Specefic pathogen free，SPF） 級 Sprague Dawley（SD）大鼠，按1:1:1比例隨機分為對照組、假手術組及手術組。以上大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重280～300 g。

方法：首先測量各組SD大鼠的平均肺動脈壓等血流動力學基線參數，之后對照組給予頸背部皮下一次性注射生理鹽水（60 mg/kg），假手術組和手術組給予頸背部皮下一次性注射野百合堿 （60 mg/kg）造模。注射野百合堿4周后，采用右心導管測量各組大鼠平均肺動脈壓等血流動力學參數，造模成功后手術組遂行經胸肺動脈去神經支配術，假手術組只開胸并不進行肺動脈去神經支配術。手術2周后再采用右心導管測量各組大鼠平均肺動脈壓等血流動力學參數。之后取心肺組織觀察其顯微形態學變化，并測量右心室肥厚指數（RVHI）。（1）SD大鼠平均肺動脈壓的測量：常規麻醉大鼠，分離大鼠右側頸外靜脈，剪口后插入自制2F右心導管，導管通過壓力傳感器與生物機能實驗系統（PowerLab數據采集分析系統，澳大利亞）相連，監測壓力變化，在壓力波形的引導下，導管經上腔靜脈進入右心房、三尖瓣口、右心室，最后進入肺動脈干，測定平均肺動脈壓力等血流動力學參數。 （2）經胸去肺動脈交感神經術過程：常規麻醉大鼠（腹腔注射戊巴比妥鈉 40 mg/kg），氣管插管，連接動物呼吸機（ALC-V8S型小動物呼吸機,奧爾科特生物科技公司），設定呼吸頻率30 次/min，潮氣量10 ml/kg。常規在大鼠左側2～3肋間小切口開胸，暴露肺動脈后，剔除肺動脈主干附近結締組織，之后關胸，常規術后護理。（3）右心室肥厚指數測定：處死三組SD大鼠后，剪除心房組織，沿室間隔邊緣分離出右心室（RV），左心室（LV）和室間隔（S），濾紙吸凈組織水分，以電子天平分布稱重RV和（LV+S）質量，以公式RV/（LV+S）計算RVHI。 （4）心肺組織形態學檢查：分別取其肺組織、心臟組織，對肺組織分別進行彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色（EVG染色）和肺動脈平滑肌肌動蛋白-內皮細胞染色（SMA-VWF染色）。每只大鼠隨機選取5張肺組織切片，每張切片隨機選取10個直徑小于300 μm的肺小動脈，用IPP3D（Image-Pro Plus 3D）圖像處理軟件進行圖像分析，計算動脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）。心臟組織分別進行右心室心肌細胞膜染色（WGA染色）。每只大鼠隨機選取5張心臟組織橫斷面切片，每張切片隨機選取10個右心室心肌細胞的橫切面視野，用IPP 3D進行圖像分析，計算右心室心肌細胞的橫截面積。 （5）肺動脈交感神經的染色，將大鼠肺動脈及周圍結締組織置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋5 μm連續切片，進行酪氨酸羥化酶（abcam公司）染色。

統計學處理：應用SPSS 23.0軟件進行分析。實驗數據全部采用均數±標準差（±s）表示，組內前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠血流動力學指標變化情況（表1）

研究結果表明，手術組和假手術組在注射野百合堿第4周后，平均肺動脈壓、右心室收縮壓，以及平均右心室壓和肺動脈收縮壓均較注射前（基線水平）顯著升高 （P均＜0.01）；與對照組相比，手術組及假手術組這四項血流動力學指標均顯著升高（P均＜0.01），這表明肺動脈高壓大鼠造模成功。此外，手術組在第6周，即術后2周時，其平均肺動脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動脈收縮壓較術前顯著降低（P＜0.01），而假手術組術后與術前相比持續升高（P＜0.01）；同時術后2周時，與假手術組相比，手術組平均肺動脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動脈收縮壓明顯下降（P＜0.01）。

表1 三組大鼠血流動力學指標變化情況（mmHg，±s）

表1 三組大鼠血流動力學指標變化情況（mmHg，±s）

注：與基線水平相比*P＜0．01；與對照組相比△P＜0．01；與同組術前相比▲P＜0．01；與假手術組相比 #P＜0．01。1 mmHg=0．133 kPa

項目 對照組(n=8) 假手術組(n=8) 手術組(n=8)平均肺動脈壓基線水平 16．8±1．3 16．4±1．2 16．9±1．2第 4 周 (術前 ) 17．1±1．4 28．6±1．5*△ 29．0±1．9*△第 6周 (術后二周) 17．4±1．5 35．3±2．5▲ 21．5±1．6▲#右心室收縮壓基線水平 29．0±1．9 29．2±1．5 29．4±2．0第 4 周 (術前 ) 29．3±1．8 49．9±3．6*△ 50．8±2．9*△第 6周 (術后二周) 30．0±2．0 60．9±5．2▲ 34．0±1．7▲#平均右心室壓基線水平 12．2±1．1 12．1±1．2 12．0±1．3第 4 周 (術前 ) 12．0±1．2 20．8±2．0*△ 21．1±1．8*△第 6周 (術后二周) 12．3±1．4 26．4±1．2▲ 16．0±1．5▲#肺動脈收縮壓基線水平 26．0±1．9 25．7±1．6 26．4±1．4第 4 周 (術前 ) 26．6±1．6 48．4±3．8*△ 50．6±4．0*△第 6周 (術后二周) 26．7±1．4 61．0±3．9▲ 31．0±1．7▲#

2.2 三組大鼠肺小動脈中層壁厚占外徑的百分比及形態學比較（圖1）

三組大鼠肺小動脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）統計結果表明：與對照組相比，假手術組肺小動脈中層平滑肌厚度明顯增厚[（39.7%±3.3%）vs（ 22.3%±1.5%），P＜0.01]； 與 假 手 術 組 相比，手術組的肺小動脈中層平滑肌厚度明顯減輕[（30.8%±2.1%） vs （39.7%±3.3%），P＜0.01]。三組大鼠肺小動脈EVG和SMA-VWF染色結果顯示:對照組肺小動脈管壁清楚菲薄，血管內皮扁平；假手術組肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄甚至閉塞，平滑肌細胞增生，血管內皮肥厚，重構特征明顯；手術組肺小動脈管壁清楚，管腔不狹窄，中層平滑肌肥厚減輕（圖1）。

圖1 三組大鼠肺小動脈彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色和肺動脈平滑肌肌動蛋白-內皮細胞染色

2.3 三組大鼠右心室肥厚指數（表2）及右心室心肌細胞形態學比較（圖2）

研究結果顯示，與對照組相比，假手術組右心室心肌細胞橫截面積和RVHI明顯增大（P均＜0.01）；與假手術組相比，手術組右心室心肌細胞橫截面積明顯減小、RVHI明顯降低（P均＜ 0.01）（表2）。右心室心肌細胞膜染色顯示，與對照組相比，假手術組右心室心肌細胞明顯增大肥厚；與假手術組相比，手術組右心室心肌細胞明顯減小，肥厚程度減輕。

表2 三組大鼠右心室心肌細胞橫截面積及右心室肥厚指數的比較（±s）

表2 三組大鼠右心室心肌細胞橫截面積及右心室肥厚指數的比較（±s）

注：與對照組相比 *P＜0．01；與假手術組相比△P＜0．01

項目 對照組(n=8)假手術組(n=8)手術組(n=8)右心室肥厚指數 (%) 28．4±1．2 46．7±1．3* 34．4±1．0△右心室心肌細胞橫截面積 (μ m2) 128±11．0 539±19．0* 230±14．0△

圖2 三組大鼠右心室心肌細胞膜染色

2.4 肺動脈周圍交感神經的酪氨酸羥化酶染色結果（圖3）

分離大鼠肺動脈及其周圍結締組織進行交感神經的酪氨酸羥化酶染色，發現其肺動脈主干周圍結締組織中存在大量交感神經分布。

圖3 肺動脈周圍交感神經的酪氨酸羥化酶染色

3 討論

有臨床研究表明，交感神經系統在肺動脈高壓患者中激活[13]，也有研究發現肺動脈高壓患者血漿去甲腎上腺素水平升高，并且與肺動脈壓、肺血管阻力相關[14]。交感神經系統的激活可能是肺動脈高壓患者肺血管重塑及右心室功能障礙的促進因素[15]。其具體機制可能是由于患者交感神經系統激活，血漿去甲腎上腺素水平增加，增加的去甲腎上腺素通過肺動脈平滑肌上的α1受體介導了肺動脈平滑肌的增殖失調和肺血管的異常收縮，從而導致肺血管重塑和肺動脈壓力升高，進而促成右心室后負荷增加、右心衰竭。那么，如果經胸去除肺動脈周圍交感神經，是否會達到改善肺動脈高壓患者血流動力學，改善肺血管重構及右心室肥厚？本實驗中，我們通過成功構建肺動脈高壓大鼠，并實施這一外科手段來印證這一假設。

首先，本實驗證明在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠，其肺動脈主干周圍結締組織中存在大量交感神經纖維。而這為肺動脈高壓中交感神經系統的激活提供了基礎。在切除這部分結締組織后，與假手術組相比，手術組的右心室收縮壓、平均肺動脈壓力明顯下降，而且隨著肺動脈壓力的下降，手術組的肺小動脈中層平滑肌厚度明顯減輕，右心室心肌細胞橫截面積和RVHI明顯減小，肺血管重構和右心室肥厚明顯改善。與經皮肺動脈去神經術相比，由于本研究發現大鼠肺動脈周圍交感神經主要分布在肺動脈壁外的結締組織中，所以經胸手術切除這些富含交感神經的結締組織可以更加徹底地實現肺動脈去神經化的目的，加強了手術效果。此外，該外科干預手段可避免導管射頻消融對消融處肺動脈內皮的炎癥性損傷。

雖然本研究首次證明經胸肺動脈去神經支配術可以有效降低野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型的肺動脈壓力，改善其肺動脈重構及右心室肥厚，為臨床干預和治療肺動脈高壓提供了新的潛在方向，但依然存在一些局限性。本實驗中應用野百合堿制作了肺動脈高壓大鼠模型，野百合堿通過選擇性損傷肺血管內皮，引起慢性血管炎性病變，進而導致肺動脈高壓和肺血管重構[16]，這一定程度模擬了臨床上特發性肺動脈高壓的模型，但該手術對于其它病因所致的肺動脈高壓是否有效仍需進一步探索。同時由于缺乏相關實驗設備，我們并未檢測三組大鼠心排量和肺動脈阻力，從而沒能全面反映各組大鼠的心功能狀態和肺血管阻力。此外，這一外科手段對肺動脈高壓大鼠的治療作用，其具體分子機制還需進一步探索。

[1]Chin KM, Rubin LJ. Pulmonary arterial hypertension [J]. J Am Coll Cardiol, 2008, 51 (16): 1527-1538. DOI: 10. 1016/j. jacc. 2008. 01.024.

[2]Hansmann G. Pulmonary hypertension in infants, children, and young adults[J]. J Am Coll Cardiol, 2017, 69 (20): 2551-2569. DOI: 10.1016/j. jacc. 2017. 03. 575.

[3]Farber HW, Loscalzo J. Pulmonary arterial hypertension[J]. N Engl J Med, 2004, 351 (16): 1655-1665. DOI: 10. 1056/NEJMra035488.

[4]楊濤, 何建國. 對肺動脈高壓患者的管理應有一套完整的策略—2009 年歐洲肺動脈高壓診斷和治療指南解讀[J]. 中國循環雜志,2012, 27（Supplment）: 81-86. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614.2012.

[5]羅鵬, 黃石安, 何建國. 動脈型肺動脈高壓靶向藥物治療的中國證據[J]. 中國循環雜志. 2014, 29（7）: 552-554. DOI: 10. 3969/j.issn. 1000-3614. 2014. 07. 019.

[6]Velez-Roa S, Ciarka A, Najem B, et al. Increased sympathetic nerve activity in pulmonary artery hypertension[J]. Circulation, 2004,110(10): 1308-1312. DOI: 10. 1161/01. CIR. 0000140724. 90898. D3.

[7]Ciarka A, Doan V, Velez-Roa S, et al. Prognostic significance of sympathetic nervous system activation in pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 11(11): 1269-1275.DOI: 10. 1164/rccm. 200912-1856OC.

[8]Mak S, Witte KK, Al-Hesayen A, et al. Cardiac sympathetic activation in patients with pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2012, 302 (10): R1153-1157. DOI: 10.1152/ajpregu. 00652. 2011.

[9]de Man FS, Handoko ML, Guignabert C, et al. Neurohormonal axis in patients with pulmonary arterial hypertension: friend or foe?[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(1): 14-9. DOI: 10. 1164/rccm.201209-1663PP.

[10]Chen SL, Zhang YJ, Zhou L, et al. Percutaneous pulmonary artery denervation completely abolishes experimental pulmonary arterial hypertension in vivo[J]. Euro Intervention, 2013, 9(2): 269-276. DOI:10. 4244/EIJV9I2A43.

[11]Chen SL, Zhang FF, Xu J, et al. Pulmonary artery denervation to treat pulmonary arterial hypertension: the single-center, prospective, firstin-man PADN-1 study (first-in-man pulmonary artery denervation for treatment of pulmonary artery hypertension)[J]. J Am Coll Cardiol,2013, 62(12): 1092-1100. DOI: 10. 1016/j. jacc. 2013. 05. 075.

[12]Chen SL, Zhang H, Xie DJ, et al. Hemodynamic, functional, and clinical responses to pulmonary artery denervation in patients with pulmonary arterial hypertension of different causes: phase Ⅱ results from the Pulmonary Artery Denervation-1 study[J]. Circ Cardiovasc Interv, 2015, 8(11): e002837. DOI: 10. 1161/CIRCINTERVENTIONS.115. 002837.

[13]Nagaya N, Nishikimi T, Uematsu M, et al. Plasma brain natriuretic peptide as a prognostic indicator in patients with primary pulmonary hypertension[J]. Circulation, 2000, 102 (8): 865-870. DOI: 10.1161/01. cir. 102. 8. 865.

[14]Nootens M, Kaufmann E, Rector T, et al. Neurohormonal activation in patients with right ventricular failure from pulmonary hypertension:relation to hemodynamic variables and endothelin levels[J]. J Am Coll Cardiol, 1995, 26 (7): 1581-1585. DOI: 10. 1016/0735-1097(95)00399-1.

[15]Maron BA, Leopold JA. Emerging concepts in the molecular basis of pulmonary arterial hypertension: part Ⅱ: neurohormonal signaling contributes to the pulmonary vascular and right ventricular pathophenotype of pulmonary arterial hypertension[J]. Circulation,2015, 131 (23): 2079-2091. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 114.006980.

[16]Hill NS, Gillespie MN, McMurtry IF. Fifty years of monocrotalineinduced pulmonary hypertension: what has it meant to the field? [J].Chest, 2017, 152 (6): 1106-1108. DOI: 10. 1016/j. chest. 2017. 10.007.