南豐蜜桔汁乳酸菌發酵過程中品質的變化

楊 沖,彭 珍,熊 濤

(南昌大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

我國是柑桔原產地之一,年產量居世界第三位,僅次于巴西、美國[1-2],而江西省作為贛南-湘南-湖南-桂北柑桔帶的優勢區,是全國柑桔的重要產地[3],具有豐富的寬皮柑桔資源[4],以贛南特產南豐蜜桔為代表,歷史上就以果色金黃、皮薄肉嫩、食不存渣、風味濃甜、芳香撲鼻而聞名中外。有研究表明,蜜桔中富含有機酸、糖類、VC、VE、β-胡蘿卜素、氨基酸和礦物質等營養元素,黃酮類物質和檸檬苦素類物質則構成其特有的苦味成分[5-6]。蜜桔本身具有潤肺、止咳、化痰、健脾、順氣、止渴的藥效[7]。因此,對蜜桔的研究和開發具有重要的價值。近年來,不僅全汁發酵的系列柑桔果酒、柑桔白蘭地和柑桔果醋(調味醋和飲料醋)[8-9]不斷被研發,果膠、香精油、橙皮色素、檸檬苦素等系列高附加值產品也在食品、化工、保健品和化妝品等領域廣泛應用[[10-12]。但是,關于系統研究乳酸菌發酵蜜桔飲料的相關研究也較少,李輝[13]用酵母菌和乳酸菌復合發酵冬棗柑桔汁,得到了冬棗柑桔復合汁的最佳發酵工藝;李妍等[14]應用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)進行發酵制作乳酸菌發酵飲料,優化發酵工藝;郭麗等[15]對柑桔乳酸菌飲料的工藝進行了研究。相關文獻多集中在工藝研究,選用的菌種多集中于保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌等,而針對乳酸菌單菌發酵柑桔飲料發酵前后主要成分的變化的研究較少。

本文首次用乳酸菌單菌發酵贛南特產南豐蜜桔汁,探究發酵過程中菌落數、pH、總酸度、有機酸和糖類隨發酵時間的變化規律,對發酵前后維生素C、總黃酮、多酚和氨基酸含量進行分析,期望為南豐蜜桔的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豐蜜桔 產地江西省南豐縣,果形扁圓,果皮薄,均重25 g左右;南豐蜜桔專用乳酸菌劑NCU1125 實驗室篩選菌株真空冷凍干燥法制得;果糖、蔗糖、葡萄糖、草酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸(標準品) 索萊寶公司;其他試劑 均為國產分析純。

MideaPHS-25pH型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;WMZK-02型厭氧培養箱 上海華辰醫用儀器有限公司;TG16-W微量高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;HP1260 高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌發酵南豐蜜桔的工藝流程 南豐蜜桔→挑選→壓榨→紗布過濾→加7%果葡糖漿調配→水浴滅菌(95 ℃,25 min)→冷卻至室溫→加入3(m/m)的乳酸菌劑(活菌數1011CFU/mL)→37 ℃恒溫發酵(60 h)→發酵后南豐蜜桔汁原漿→蔗糖調配→蜜桔飲料[16]。

1.2.2 pH的測定 取5 mL發酵后的南豐蜜桔汁原漿于小燒杯中,pH計直接測定。

1.2.3 總酸度的測定 按照GB/T 12456-2008堿滴定法測定發酵過程中酸度。

1.2.4 菌落數的測定 平板稀釋活菌計數法[17]。取1 mL發酵液加入到9 mL滅菌冷卻的生理鹽水中,再依次做10倍系列濃度稀釋,選取三個適當稀釋梯度的發酵液,分別吸取這三個稀釋液100 μL于無菌的MRS固體培養基上涂布至稀釋液干燥,將培養皿倒置于37 ℃培養箱中,培養24 h后,選取菌落數在30～300個之間的平板進行計數。

1.2.5 有機酸的測定 參照Xiong T等[18]的方法。

1.2.5.1 流動相的配制 0.5 mol/L的硫酸,超聲波脫氣后備用。

1.2.5.2 色譜條件 AMINEXHPX-87H離子交換柱(300×7.8 mm);流動相為6 mmol/L硫酸溶液,流速為0.5 mL/min,柱溫45 ℃,紫外檢測器檢測波長205 nm;選用示差折光檢測器檢測糖醇(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量,紫外檢測器檢測草酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸的含量。

1.2.6 多酚含量的測定 福林酚法[19-20];總黃酮含量的測定:GB/T 12143附錄G總黃酮的測定;維生素C含量測定:紫外分光光度法[21]。以上每個樣品均重復3次。

1.2.7 游離氨基酸的測定 根據GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》,利用氨基酸分析儀測定南豐蜜桔汁發酵前后氨基酸的種類及含量。

1.2.8 數據處理 實驗數據利用SPSS 20.0軟件,采用單因素方差分析進行顯著性差異比較(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 南豐蜜桔汁乳酸菌發酵過程中總酸度、pH和菌落數的變化

總酸度和pH是發酵過程中極為重要的參數,直接影響著微生物的生長及代謝產物的生成[22],而且在一定程度上間接的反映發酵液微生物的生長代謝情況。因此,在乳酸菌發酵南豐蜜桔汁中,考查總酸度、pH和菌落數隨發酵時間的變化規律,對于了解發酵過程中微生物的生長代謝、判斷桔汁發酵程度具有指導意義。

由圖1(a)可知,在0～2 h左右,是乳酸菌的延滯期,活菌數略有減少,但是3 h以后乳酸菌快速增長進入對數期,在發酵10 h左右進入穩定期,活菌數為3.3×109CFU/mL。在發酵48 h左右,乳酸菌進入衰亡期,60 h以后活菌數仍然保持在2×109CFU/mL,故乳酸菌能夠較好的適應桔汁發酵環境,發酵結束后存活率仍在67%以上。

由圖1(b)可知,總酸度含量整體呈上升趨勢。在0～6 h的發酵期間,總酸度變化不明顯,6 h以后,總酸度呈現先快速上升后緩慢的增加直至48 h后穩定不變的趨勢,發酵結束后總酸度為15.64 g/kg,較發酵前總酸度提高6倍。可能總酸度的變化與乳酸菌生長特性有關:發酵前期乳酸菌處于遲滯期,此時乳酸菌并不產酸,進入對數期后,乳酸菌利用糖類生長繁殖并產生乳酸等代謝產物;有機酸的產生使桔汁酸度升高[23],隨著發酵的進行,桔汁中積累大量有機酸,導致環境中pH下降,高濃度的酸性環境和H+會抑制乳酸菌生長與代謝,進而使菌的產酸能力受到影響,發酵后期酸度變化不明顯。

圖1 發酵過程中菌落數、總酸度和pH隨發酵時間的變化Fig.1 Variation of colony forming unit and total acidity and pH value during the fermentation process

pH在發酵期間呈現下降趨勢,在6～12 h迅速下降,此階段pH的快速下降主要是因為乳酸菌的快速增殖消耗糖代謝產酸。另一方面,由于桔汁開始時的介質緩沖能力較低,所以發酵初期產生的少量乳酸也能導致其pH下降顯著。在36 h時,pH下降到3.2,36 h后穩定不變。綜上所述,可以看出乳酸菌適應強酸環境發酵桔汁飲料,本實驗與Darko Dimitrovski等關于植物乳桿菌PCS26發酵菊芋功能飲料的研究相符[24]。

對比pH的變化,可以看出發酵桔汁中總酸度呈現增加的趨勢,發酵36～48 h期間,pH幾乎穩定不變,而總酸度仍在緩慢增加。這是由于pH的大小不僅取決于有機酸的種類與數量,而且受桔汁中緩沖物質總量及其緩沖能力的影響[22],因此,pH與其總酸度之間并沒有嚴格的比例關系。

2.2 南豐蜜桔汁乳酸菌發酵過程中糖類物質含量的變化

圖2為上述3種底物在桔汁發酵過程中的變化趨勢。葡萄糖、果糖和蔗糖是蜜桔汁發酵體系中的主要碳源,初始含量分別為20.97、22.36、42.88 mg/g,主要來源于添加的果葡糖漿和桔汁中本身含有的少量糖類。隨著發酵進行,果糖、葡萄糖、蔗糖含量都呈現下降趨勢,發酵6 h之后,乳酸菌直接利用果糖和葡萄糖或者本身具有蔗糖水解酶分解蔗糖產生的果糖和葡萄糖進行發酵[25],使得發酵桔汁中果糖、葡萄糖、蔗糖含量快速下降。發酵40 h之后,三者含量的變化緩慢,是因為在發酵后期,發酵桔汁中的環境因素(如高濃度酸,低pH)在一定程度上對乳酸菌有抑制作用,乳酸菌的代謝活動減慢,三糖的利用率逐漸下降[26]。發酵結束后,總糖濃度減少了11.03 mg/g,減少的糖類物質用于菌的生長以及在發酵代謝中轉化成其他的有機酸等營養物質。

圖2 發酵過程中糖類濃度的變化Fig.2 Changes in glucide concentrations during the fermentation

2.3 南豐蜜桔汁乳酸菌發酵過程中有機酸含量的變化

對不同發酵時間桔汁發酵液取樣測定有機酸含量變化,得到發酵液中各有機酸含量變化見圖3。

圖3 蜜桔發酵過程中有機酸含量的變化Fig.3 Changes of organic acids during the fermentation process of Nan Feng orange

酸是發酵果蔬汁中重要的一種味感,是衡量果汁發酵質量好壞的重要指標之一,有機酸除來自蜜桔原料以外,還在乳酸菌發酵蜜桔的代謝過程中產生。從圖3可以看出在蜜桔發酵前,檸檬酸、蘋果酸、乙酸含量最高,分別為8.6、4.2、3.9 mg/g,是蜜桔的主要有機酸,此外還檢測到草酸和乳酸,但是含量較少。乳酸在整個發酵期間呈現一直增加趨勢,由最初濃度0.44 mg/g到發酵結束后濃度13.05 mg/g,含量增加了28倍(p<0.05),這是因為在發酵過程中,乳酸菌利用葡萄糖,經同型發酵中的糖酵解過程,產生了大量的乳酸[27]。

乙酸可能作為乳酸菌的代謝底物被消耗,在發酵中期消失(p<0.05)。發酵后,蘋果酸含量下降到3.69 mg/g,減少了近30.3%(p<0.05),這是因為蘋果酸可以作為乳酸菌的代謝底物,在蘋果酸脫酸酶的催化下,轉化成了部分乳酸[29]。檸檬酸是蜜桔中的主要有機酸,檸檬酸含量下降到6.5 mg/g,減少了近22.4%(p<0.05),可能是在發酵過程中,部分檸檬酸作為乳酸菌菌體的營養成分和轉化成其他代謝產物[28],而草酸含量在整個發酵過程中并沒有顯著性變化(p>0.05)。

在發酵結束時有機酸總含量提高了5.5 mg/g,較發酵前顯著提高。乙酸、乳酸是乳酸菌發酵果汁產生的短鏈脂肪酸[29-30],短鏈脂肪酸含量由發酵前的5.23 mg/g增加到發酵后的13.05 mg/g,其中乳酸酸味柔和醇厚,是發酵后桔汁中主要的短鏈脂肪酸。有機酸對蜜桔發酵過程中的乳酸菌有抑制作用對原漿的風味有重要影響,正是不同有機酸在發酵果蔬汁的風味形成中既發揮各自獨特的作用,又會相互協調[31],形成了發酵蜜桔汁獨特的發酵風味。

2.4 南豐蜜桔汁乳酸菌發酵過程中主要抗氧化物質含量的變化

人體的衰老效應和多種疾病與體內自由基有關。實驗證明食物中尤其是水果和蔬菜中含有的多酚、黃酮、維生素等物質具有抗氧化性,可清除體內有害自由基,延緩衰老進程,預防各種慢性疾病的發生[32-33]。

發酵前后維生素C、總黃酮和多酚的含量測定結果見表1。由表1可知,經乳酸菌代謝產生的低pH環境具有保護維生素C不被氧化、分解的作用[34],蜜桔經乳酸菌發酵后,維生素C的含量減少,但仍保持在80%以上,可能是部分維生素C作為代謝底物被乳酸菌在發酵中利用,產生有機酸和轉化其他維生素,果汁中具有抑菌作用的多酚類物質[35]和蛋白質反應生成大分子聚合物[36],而總黃酮和多酚物質含量卻在發酵后顯著性增加(p<0.05)。一方面乳酸菌在發酵過程中能產生某些酯酶水解一些結合酚,釋放果蔬中的游離酚。另一方面,發酵過程中產生的有機酸,也會防止酚類物質的降解[37],此外,乳酸菌在發酵過程中產生一些酚酸脫羧酶,能使酚類物質之間實現相互轉化,可能把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質[38-39]。

表1 蜜桔飲料發酵前后成分變化Table 1 Changes of components of Nan Feng orange before and after fermentation

2.5 南豐蜜桔汁乳酸菌發酵前后游離氨基酸含量的變化

利用氨基酸分析儀測定南豐蜜桔汁發酵前后氨基酸的種類及含量,結果見表2,由表中可知,發酵前南豐蜜桔漿中共檢測出17種氨基酸,總量為2.28 mg/g,其中必需氨基酸有7種,分別是纈氨酸(0.019 mg/g)、賴氨酸(0.046 mg/g)、異亮氨酸(0.009 mg/g)、亮氨酸(0.013 mg/g)、蛋氨酸(0.004 mg/g)蘇氨酸(0.038 mg/g)和苯丙氨酸(0.053 mg/g),占游離氨基酸的7.9%。蛋氨酸和半胱氨酸為南豐蜜桔中的限制性氨基酸。發酵后游離氨基酸總量為1.961 mg/g,較發酵前顯著減少(p<0.05),其中異亮氨酸、酪氨酸在發酵后未被檢出,天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量顯著性減少(p<0.05),在發酵后期含量下降可能是因為微生物的大量繁殖利用程度強于相關蛋白質的水解強度以及這些氨基酸在發酵過程下發生了氧化和轉化[40],也可能被乳酸菌代謝利用合成其他揮發性芳香物質;半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸在發酵后含量均有所增加,可能是發酵后期乳酸菌死亡,菌體蛋白降解導致[41],丙氨酸為南豐蜜桔發酵后的限制性氨基酸。

表2 南豐蜜桔汁發酵前后氨基酸變化Table 2 Changes of amino acid of Nan Feng orange before and after fermentation

參照YLVA A等[41-43]的分類方法,根據呈味不同,氨基酸可以分為甜味氨基酸(Ala、His、Pro、Ser、Thr、Gly)、鮮味氨基酸(Glu、Lys、Asp)、苦味氨基酸(Arg、Ile、Leu、Val、Trp、Met)、酸味氨基酸(Asp、Gly)和芳香味氨基酸(Tyr、Cys、Phe)。由圖4可知,南豐蜜桔發酵后呈味氨基酸組成發生變化,鮮味氨基酸由0.251 mg/g減少到0.09 mg/g,苦味氨基酸由1.095 mg/g減少到0.891 mg/g,減少了18.6%,酸味氨基酸含量由0.167 mg/g增加到0.27 mg/g,甜味氨基酸含量由0.862 mg/g減少到0.682 mg/g,芳香味氨基酸含量由0.074 mg/g減少到0.012 mg/g。南豐蜜桔的口感是由氨基酸與糖類、酸類、酯類等其他呈味物質共同作用產生的,發酵后酸味氨基酸含量增多,加之苦味氨基酸含量顯著性減少(p<0.05),一定程度改善了南豐蜜桔的口感。

圖4 南豐蜜桔汁發酵前后呈味氨基酸的變化Fig.4 Changes of flavor amino acids of Nan Feng orange before and after fermentation 注：不同字母表示發酵前發酵后 氨基酸含量差異顯著(p<0.05)。

3 結論

乳酸菌能夠較好的適應南豐蜜桔汁發酵環境,發酵3 h左右,乳酸菌進入對數期,10 h后進入穩定期,60 h以后活菌量仍然在2×109CFU/mL,發酵結束后pH下降至3.2左右,總酸度顯著性提高了近6倍(p<0.05)。乳酸菌發酵對草酸含量沒有顯著影響(p>0.05),檸檬酸、蘋果酸、乙酸含量呈下降趨勢,特別是乙酸在發酵中期消失,乳酸顯著性增加(p<0.05),質量濃度由0.44 mg/g增加至13.05 mg/g。短鏈脂肪酸由發酵前的5.23 mg/g增加到13.05 mg/g,大大提高了蜜桔的保健功能。南豐蜜桔汁發酵前后,維生素C含量顯著性減少(p<0.05),總黃酮和多酚類化合物含量顯著性增加了12.9%和8%(p<0.05)。發酵后氨基酸總量減少了13.9%,呈味氨基酸組成發生變化。乳酸菌可以作為發酵型南豐蜜桔汁的發酵劑,南豐蜜桔汁乳酸菌發酵可以提高其營養保健價值,改善風味。

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