超聲波對肌原纖維蛋白理化和質構特性的影響

王靜宇,楊玉玲,周 磊,張 興,魏蘇萌

(南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心, 江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

超聲波作為一種快速、高效并且可靠的新興技術,已經在食品加工行業得到廣泛的應用[1-2]。它是指頻率超過人類的聽覺范圍的一種彈性的機械振蕩,其頻率通常為20～1000 kHz。根據超聲波的頻率以及所產生的能量大小,可以將其分為低頻率高場強(頻率為20～100 kHz,場強為10～1000 W/cm2)和高頻率低場強(頻率為100～1000 KHz,場強<1 W/cm2)兩種類型[3]。由于前者的能量較大,在食品工業中通常用此頻率來改善物料的理化特性[4],同時超聲波還可用于改變蛋白質的結構[5]。

雞肉是非常受消費者歡迎的一種原料肉,雞胸肉的脂肪含量較低而且具有較高的營養價值,是良好的動物蛋白質來源[6]。而肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MP)是雞胸肉中的主要蛋白質,約占其總蛋白含量的40%～60%[7]。質構特性又是MP熱誘導凝膠的重要的功能特性之一。有文獻表明,超聲處理能夠提高其凝膠的硬度[8]。Zisu等[9]的研究表明采用超聲探頭(20 kHz,4000 W)能夠降低乳清蛋白和酪蛋白的粘性,并增加其凝膠性。Jambrak等[10]指出超聲能夠增加大豆分離蛋白的表面疏水性。同時超聲波處理后的大豆分離蛋白的二硫鍵和表面疏水性也都有增加[11]。Gulseren等[12]研究表明超聲能夠顯著提高乳清蛋白的溶解性并將其流變性改為剪切稀化流體。Jiang等[13]通過對黑豆蛋白經過高場強的超聲波處理,發現對其粒徑和靜電斥力的影響結果相反。

目前,國內外尚未見超聲波對MP的理化與質構特性共同影響的報道,因此研究超聲波對MP理化與質構特性之間的影響,不僅為超聲波提高肉制品品質具有重要意義,而且還在肌肉肉糜凝膠制品中的應用提供技術參數和理論依據。

本文通過不同超聲功率0、100、200、300、400和500 W處理MP,然后測定其電位、粒徑、表面疏水性、溶解度、流變特性以及凝膠的硬度和微觀結構,探討不同超聲功率對MP理化和質構特性影響的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛撥益加雞(Arbor Acres,AA) 30只,其中公雞和母雞各15只,屠宰后取雞胸肉,于-18 ℃下儲存,一個月內使用,購于南京青龍山養雞場;牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA) 國藥集團化學試劑有限公司,其他化學試劑 均為分析純。

JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Avanti J-26XP高效冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠;F-7000 型熒光分光光度儀、U-3900紫外分光光度儀、日本TM 3000掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Zeta 電位分析儀[Zetasizer Nano ZS90] 英國馬爾文公司;Anton Paar MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司;TA-XT plus質構分析儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 雞胸肉于4 ℃下解凍20 min,剔除結締組織和脂肪,切碎后稱取40 g,加入8倍分離緩沖液(0.1 mol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L DTT,10 mmol/L K2HPO4,pH7.0),冰浴,10000 r/min條件分散10 s,間隔10 s,分散3次,在2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀,重復該步驟共3次。加入8倍分離緩沖液(0.1 mol/L NaCl,pH6.0,含1 mmol/L NaN3),10000 r/min條件分散10 s,分散1次后,用一層干燥潔凈的紗布過濾,2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀,重復該步驟3次,得到提純的MP沉淀。蛋白濃度的測定采用雙縮脲方法,具體參考楊玉玲等[14],4 ℃下保存。

1.2.2 MP的超聲波處理以及凝膠的制備 處理方法參照Wang等[15],且稍做改動,將MP用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L KH2PO4,0.6 mol/L KCl,pH6.0)溶解,稀釋至質量濃度30 mg/mL的MP溶液,取20 mL該溶液于50 mL離心管中,并將其放在裝有碎冰的燒杯中,一起置于超聲波細胞破碎儀中(超聲探頭為頻率20 kHz,直徑6 mm的鈦金屬探頭),設置超聲功率為0、100、200、300、400、500 W(工作時間和間歇時間分別為1 s和3 s),超聲時間設為6 min,加碎冰控制樣品溫度為4～8 ℃,處理后的樣品于0～4 ℃冰箱內儲存備用。將不同超聲功率處理后的蛋白溶液配制成濃度為5 mg/mL和0.5 mg/mL,前者用于溶解度的測定,后者用于粒徑、Zeta電位和表面疏水性的測定。將超聲處理后的蛋白樣品(30 mg/mL)置于水浴鍋中從20℃程序升溫至65 ℃(1 ℃/min)制成凝膠,保溫20 min,取出,冷卻至室溫,凝膠在4 ℃下保存9～16 h,制備的MP凝膠用于質構特性和微觀結構的測定。

1.2.3 粒徑的測定 將超聲波處理后的MP樣品緩慢加入Malvern動態光散射粒度儀中,達到測試范圍,進行測試[16],每次測定最終粒徑分布都為連續3次測試的平均值。

1.2.4 表面疏水作用測定 測定方法參照Wang等[15],將超聲波處理后的MP樣品,稀釋到一系列濃度(0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL)。每個濃度取2 mL,分別加入10 μL緩沖液(8 mmol/L ANS、0.1 mol/L KH2PO4,pH6.0),混勻,黑暗中靜置20 min后用于測定表面疏水性。熒光分光光度計的激發波長為374 nm,發射波長為485 nm。以熒光強度對蛋白濃度作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質的表面疏水性指標(S0-ANS)。

1.2.5 溶解度的測定 取超聲波處理后的MP樣品于7 mL離心管中,于4 ℃下10000×g離心10 min,立即取上清液1 mL,并加入4 mL雙縮脲試劑,混勻,于室溫處靜置30 min,540 nm下測定吸光度,重復3 次。空白對照為1 mL(0.6 mol/L KCl)和4 mL雙縮脲試劑的混合液。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度與總蛋白質量濃度的百分比[17]。

1.2.6 Zeta電位的測試 測定方法參照張興等[16],將MP樣品注入Zeta電位皿后,加塞,進行電位測試。測試參數:散射角:90°,平衡時間:60 s,測試溫度:25 ℃。

1.2.7 動態流變的測定 將不同功率超聲處理后的蛋白溶液,配制成濃度為30 mg/mL的樣品用于流變特性的測定。動態流變的測定條件:直徑50 mm平行板,狹縫0.5 mm,應變2%,頻率0.1 Hz。升溫速率1 ℃/min,升溫范圍20～80 ℃。

1.2.8 微觀結構的測定 MP凝膠的微觀結構用掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)測定,將制備的凝膠切成5 mm厚的小塊,用3%的戊二醛固定2 h,之后用緩沖液(0.1 mol/L KH2PO4,pH6.0)清洗1 h,再進行不同梯度的乙醇脫水(50%、70%、90%、95%、100%),每次30 min,再用叔丁醇置換3次,-20 ℃預凍2 d,-70 ℃冷凍干燥72 h,噴金鍍膜后用SEM觀察微觀結構,加速電壓15 kV。

1.2.9 質構特性的測定 方法參考楊玉玲等[14],MP凝膠的硬度采用質構儀的TPA(Texture profile analyse,TPA)法測定。參數設置如下:選用P/6探頭,測試前速度5 mm/s,測試中速度1 mm/s,測試后速度5 mm/s,探頭深入距離為5 mm。每個樣品共3個重復。

1.2.10 統計分析 每個實驗三次重復。用SPSS 17.0軟件進行相關性分析和方差分析,如果方差分析效應顯著,使用Duncan multiple range test進行多重比較(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理對MP粒徑的影響

如圖1所示,超聲處理后,MP的平均粒徑整體顯著降低。經超聲波處理,MP的平均粒徑從1914.67 nm(0 W)顯著降低到980.7 nm(100 W)(p<0.05),而后隨著超聲功率的增加又緩慢降低至624.5 nm(500 W)(p<0.05)。粒徑變化主要由蛋白分子內的交聯和聚集引起的[18]。粒徑剛開始顯著降低的原因可能是由于超聲引起的空穴效應以及微束流效應產生的物理作用打斷了MP之間的非共價鍵作用。而后隨著功率的增加,粒徑變化相對100 W時變化慢,可能是由于MP分子已經打開,分子間的相互作用相對變弱。Hu等[19]指出超聲波能夠降低大豆分離蛋白的粒徑。

圖1 超聲波處理對MP粒徑的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment on particle size of MP注：不同小寫字母表示處理間 差異顯著(p<0.05);圖2～圖7同。

2.2 超聲波處理對MP表面疏水作用的影響

表面疏水性反映的是蛋白表面疏水集團數量以及溶劑質量的一個指標。如圖2所示,隨著超聲功率的增加,MP的表面疏水性從398.63(0 W)顯著增加到772.29(500 W)(p<0.05)。這表明在超聲之前,很多疏水集團都包埋在蛋白分子或者聚合物內部,由于超聲波的空穴效應和微流束作用,能夠使這些集團暴露出來,這樣ANS就很容易與原本埋藏在分子內部的疏水集團結合,從而MP的表面疏水性增加。Chen等[20]有相似的報道,超聲處理后蛋白的表面疏水性顯著增加。

圖2 超聲波處理對MP表面疏水性影響Fig.2 Effect of ultrasound treatment on surface hydrophobicity of MP

2.3 超聲波處理對MP溶解度的影響

溶解度是蛋白質功能性質之一,可以作為衡量蛋白質變性和聚集的一種方法。MP經超聲波處理后其溶解度的變化如圖3所示,隨著超聲功率的增強,溶解度先從8.15%(0 W)增加到12.45%(300 W)(p<0.05),而后急劇增加到15.04%(400 W)(p<0.05),最后緩慢增加到15.50%(500 W)(p>0.05)。超聲處理后平均粒徑的降低導致其溶解度的增加(圖3);而高強度的超聲波可能使不溶性蛋白增多,從而使蛋白溶解度增加緩慢。Maity等[21]提出超聲波的空穴效應產生的渦旋、湍流、剪切力和高壓部分打斷了分子間疏水相互作用,使蛋白質的溶解度提高;Wang等[15]發現低強度的超聲波能夠使雞肉中的肌原纖維蛋白的溶解度增強。

2.4 超聲波處理對MP Zeta電位的影響

Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位,是表征膠體體系穩定性的重要指標,用于描述膠體顆粒之間的靜電相互作用[22-23]。如圖4所示,MP的電位全是負值,說明蛋白表面負電荷要比正電荷多,凈電荷為負電荷。不同功率的超聲處理MP的Zeta電位絕對值逐漸增大,表明蛋白質所帶負電荷逐漸增加,蛋白質展開程度增加。MP的Zeta電位絕對值在100 W內,沒有顯著變化(p>0.05),然而隨著超聲功率的增加,Zeta電位絕對值先從5.43 mV(100 W)顯著增加到7.40 mV(500 W)(p<0.05)。蛋白分子表面的電荷主要取決于其狀態:分散或者聚集[24]。因此,Zeta電位絕對值增加的原因可能是超聲破壞了蛋白分子的聚集,使得蛋白表面電荷暴露出來,負電荷增多。

圖4 超聲波處理對MP Zeta電位的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment on zeta potential of MP

2.5 超聲波處理對MP動態流變的影響

研究動態流變主要用于在不破壞蛋白結構的情況下測定凝膠形成的過程[25]。而流變的溫度掃描可以較好地說明蛋白在加熱形成凝膠過程中蛋白的物理變化。流變參數儲能模量(G′)和損耗模量(G″)分別反映流體的彈性和粘性大小。如圖5A所示,G′值從初始溫度升至48 ℃,這個過程表明彈性蛋白凝膠網絡的形成,是由于溫度增加促使肌原纖維蛋白分子打開。超過48 ℃之后G′值顯著降低,這是因為隨著溫度進一步增加,肌球蛋白尾部開始解螺旋,從而蛋白的流動性增強,導致G′值突然降低[26]。而溫度在48 ℃時,且與空白對照,當超聲功率為200 W時,G′值最大(681.2 Pa),而只有超聲功率為500 W(400.2 Pa)時,G′值低于空白組(448.6 Pa)。當溫度超過53 ℃以后,G′值又快速增加,這是因為其是形成永久的凝膠網絡結構的溫度點,而超聲處理200 W的G′值依然高于其他超聲處理的(包括未超聲處理的),可能是由于此時引力和斥力在最高水平上達到平衡,因此能形成更好的彈性凝膠。圖5B中G″的流變趨勢與G′相似,也說明了中強度的超聲處理MP(200 W),流變特性最佳。

圖5 超聲波處理對MP G′(A)和G″(B)的影響Fig.5 Effect of ultrasound treatment on storage modulus(A)and loss modulus(B)of MP

2.6 超聲波處理對MP微觀結構的影響

超聲波處理后的MP凝膠空間結構與未處理的樣品相比,結構變得更加致密均勻,網孔更小(圖6)。經過超聲100 W處理后,網絡凝膠結構變化很多,較未處理的凝膠相比,網孔變小,已經形成較好的凝膠。200 W處理后的凝膠網絡細膩,孔徑小且分布均勻,呈現蜂窩狀膠束,蛋白分子間的相互作用達到較好的平衡。當超聲時間達到300 W及以上時,靜電斥力與疏水相互作用之間的平衡遭到破壞,致使其均勻的凝膠結構遭到破壞,凝膠網孔變大,且不均勻,蛋白質凝膠網絡結構變得粗糙。

圖6 超聲波處理對MP凝膠微觀 結構的影響(電鏡照片2000×)Fig.6 Effect of ultrasound treatment on microstructure(SEM micrographs at 2000×)of MP gel

2.7 超聲波處理對MP質構的影響

質構特性是反映MP凝膠結構穩定性的重要參數。如圖7所示,隨著超聲功率的增加,MP凝膠的硬度從30.10 g(0 W)快速升至51.40 g(200 W),而后逐漸降至49.40 g(500 W)(p<0.05),這表明低強度超聲波處理(0～200 W)可以顯著增強凝膠的硬度(p<0.05),可能是由于低強度的超聲能使MP分子打開,內部的疏水集團暴露出來(圖2),當加熱成凝膠時,暴露出的疏水集團使得蛋白質分子間的距離縮短,從而增加了蛋白質之間凝集的機會,凝膠中交聯結合的更加緊密從而增強了凝膠的硬度。另外,圖5中流變特性在200 W時也是最好的。而超聲處理200 W后,凝膠網絡孔洞更小且更加致密,有利于增強凝膠的硬度(圖6)。Zhao等[27]也得出了相似的結論,低強度的超聲波能夠使蛋白的硬度增加。當超聲功率 ≥200 W,反而會降低凝膠的硬度,這可能是因為超聲波的空穴效應以及微束流能夠破壞蛋白分子間的作用力,分子間的交聯結構遭到破壞,凝膠網絡孔徑變得粗大(圖6)。由此可知,超聲功率為200 W時,MP凝膠強度最強。

圖7 超聲波處理對MP凝膠硬度的影響Fig.7 Effect of ultrasound treatment on hardness of MP gel

2.8 相關性分析

由表1可知,超聲波功率與MP的理化特性(溶解度,電位,表面疏水性)極顯著相關(p<0.01),與粒徑顯著相關(p<0.05),和硬度相關性不大(p>0.05),因此超聲波對MP的理化特性有顯著的影響;而MP凝膠硬度與電位不太相關(p>0.05),與粒徑顯著負相關,與溶解度和表面疏水性顯著正相關(p<0.05),相關系數分別為-0.890,0.814和0.813。超聲波處理降低了蛋白粒徑,導致凝膠結構改變,最終影響了凝膠的性質,Madadlou等[28]指出對蛋白粒徑的減少后,再重新聚合可以使其結合更緊密,空間結構更穩定,凝膠強度更強。與溶解度相關可能也是因為粒徑的改變。疏水相互作用是影響凝膠強度的作用力之一,而靜電斥力卻不是。

表1 超聲波與MP理化特性以及凝膠強度之間的相關性Table 1 Correlation of ultrasound,physicochemical property of MP and strengh of MP gel

3 結論

超聲波能夠顯著影響MP的理化特性(粒徑、溶解度、Zeta電位和表面疏水性)與流變特性。低場強的超聲波處理(0～200 W)促進肌原纖維蛋白適度展開,顯著降低MP的粒徑,提高其溶解度,疏水相互作用以及靜電斥力,改變其流變特性并使硬度逐漸增加。在超聲功率200 W時,蛋白分子進一步打開,此時大部分MP分子都還處于天然狀態,當加熱成膠時,MP展開的速度比聚集的速度快,此時其引力和斥力在最高水平上達到平衡,致使凝膠的網狀結構更加均勻、致密,凝膠硬度最大。而高強度超聲波處理后(300～500 W),G′、G″值和凝膠硬度都相對降低。

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