超聲波對肌原纖維蛋白理化和質(zhì)構(gòu)特性的影響

王靜宇,楊玉玲,周 磊,張 興,魏蘇萌

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

超聲波作為一種快速、高效并且可靠的新興技術(shù),已經(jīng)在食品加工行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。它是指頻率超過人類的聽覺范圍的一種彈性的機(jī)械振蕩,其頻率通常為20～1000 kHz。根據(jù)超聲波的頻率以及所產(chǎn)生的能量大小,可以將其分為低頻率高場強(qiáng)(頻率為20～100 kHz,場強(qiáng)為10～1000 W/cm2)和高頻率低場強(qiáng)(頻率為100～1000 KHz,場強(qiáng)<1 W/cm2)兩種類型[3]。由于前者的能量較大,在食品工業(yè)中通常用此頻率來改善物料的理化特性[4],同時(shí)超聲波還可用于改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[5]。

雞肉是非常受消費(fèi)者歡迎的一種原料肉,雞胸肉的脂肪含量較低而且具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,是良好的動(dòng)物蛋白質(zhì)來源[6]。而肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MP)是雞胸肉中的主要蛋白質(zhì),約占其總蛋白含量的40%～60%[7]。質(zhì)構(gòu)特性又是MP熱誘導(dǎo)凝膠的重要的功能特性之一。有文獻(xiàn)表明,超聲處理能夠提高其凝膠的硬度[8]。Zisu等[9]的研究表明采用超聲探頭(20 kHz,4000 W)能夠降低乳清蛋白和酪蛋白的粘性,并增加其凝膠性。Jambrak等[10]指出超聲能夠增加大豆分離蛋白的表面疏水性。同時(shí)超聲波處理后的大豆分離蛋白的二硫鍵和表面疏水性也都有增加[11]。Gulseren等[12]研究表明超聲能夠顯著提高乳清蛋白的溶解性并將其流變性改為剪切稀化流體。Jiang等[13]通過對黑豆蛋白經(jīng)過高場強(qiáng)的超聲波處理,發(fā)現(xiàn)對其粒徑和靜電斥力的影響結(jié)果相反。

目前,國內(nèi)外尚未見超聲波對MP的理化與質(zhì)構(gòu)特性共同影響的報(bào)道,因此研究超聲波對MP理化與質(zhì)構(gòu)特性之間的影響,不僅為超聲波提高肉制品品質(zhì)具有重要意義,而且還在肌肉肉糜凝膠制品中的應(yīng)用提供技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

本文通過不同超聲功率0、100、200、300、400和500 W處理MP,然后測定其電位、粒徑、表面疏水性、溶解度、流變特性以及凝膠的硬度和微觀結(jié)構(gòu),探討不同超聲功率對MP理化和質(zhì)構(gòu)特性影響的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛撥益加雞(Arbor Acres,AA) 30只,其中公雞和母雞各15只,屠宰后取雞胸肉,于-18 ℃下儲(chǔ)存,一個(gè)月內(nèi)使用,購于南京青龍山養(yǎng)雞場;牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其他化學(xué)試劑 均為分析純。

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;F-7000 型熒光分光光度儀、U-3900紫外分光光度儀、日本TM 3000掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Zeta 電位分析儀[Zetasizer Nano ZS90] 英國馬爾文公司;Anton Paar MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司;TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 雞胸肉于4 ℃下解凍20 min,剔除結(jié)締組織和脂肪,切碎后稱取40 g,加入8倍分離緩沖液(0.1 mol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L DTT,10 mmol/L K2HPO4,pH7.0),冰浴,10000 r/min條件分散10 s,間隔10 s,分散3次,在2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀,重復(fù)該步驟共3次。加入8倍分離緩沖液(0.1 mol/L NaCl,pH6.0,含1 mmol/L NaN3),10000 r/min條件分散10 s,分散1次后,用一層干燥潔凈的紗布過濾,2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀,重復(fù)該步驟3次,得到提純的MP沉淀。蛋白濃度的測定采用雙縮脲方法,具體參考楊玉玲等[14],4 ℃下保存。

1.2.2 MP的超聲波處理以及凝膠的制備 處理方法參照Wang等[15],且稍做改動(dòng),將MP用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L KH2PO4,0.6 mol/L KCl,pH6.0)溶解,稀釋至質(zhì)量濃度30 mg/mL的MP溶液,取20 mL該溶液于50 mL離心管中,并將其放在裝有碎冰的燒杯中,一起置于超聲波細(xì)胞破碎儀中(超聲探頭為頻率20 kHz,直徑6 mm的鈦金屬探頭),設(shè)置超聲功率為0、100、200、300、400、500 W(工作時(shí)間和間歇時(shí)間分別為1 s和3 s),超聲時(shí)間設(shè)為6 min,加碎冰控制樣品溫度為4～8 ℃,處理后的樣品于0～4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩⒉煌暪β侍幚砗蟮牡鞍兹芤号渲瞥蓾舛葹? mg/mL和0.5 mg/mL,前者用于溶解度的測定,后者用于粒徑、Zeta電位和表面疏水性的測定。將超聲處理后的蛋白樣品(30 mg/mL)置于水浴鍋中從20℃程序升溫至65 ℃(1 ℃/min)制成凝膠,保溫20 min,取出,冷卻至室溫,凝膠在4 ℃下保存9～16 h,制備的MP凝膠用于質(zhì)構(gòu)特性和微觀結(jié)構(gòu)的測定。

1.2.3 粒徑的測定 將超聲波處理后的MP樣品緩慢加入Malvern動(dòng)態(tài)光散射粒度儀中,達(dá)到測試范圍,進(jìn)行測試[16],每次測定最終粒徑分布都為連續(xù)3次測試的平均值。

1.2.4 表面疏水作用測定 測定方法參照Wang等[15],將超聲波處理后的MP樣品,稀釋到一系列濃度(0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL)。每個(gè)濃度取2 mL,分別加入10 μL緩沖液(8 mmol/L ANS、0.1 mol/L KH2PO4,pH6.0),混勻,黑暗中靜置20 min后用于測定表面疏水性。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長為374 nm,發(fā)射波長為485 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白濃度作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)(S0-ANS)。

1.2.5 溶解度的測定 取超聲波處理后的MP樣品于7 mL離心管中,于4 ℃下10000×g離心10 min,立即取上清液1 mL,并加入4 mL雙縮脲試劑,混勻,于室溫處靜置30 min,540 nm下測定吸光度,重復(fù)3 次。空白對照為1 mL(0.6 mol/L KCl)和4 mL雙縮脲試劑的混合液。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度與總蛋白質(zhì)量濃度的百分比[17]。

1.2.6 Zeta電位的測試 測定方法參照張興等[16],將MP樣品注入Zeta電位皿后,加塞,進(jìn)行電位測試。測試參數(shù):散射角:90°,平衡時(shí)間:60 s,測試溫度:25 ℃。

1.2.7 動(dòng)態(tài)流變的測定 將不同功率超聲處理后的蛋白溶液,配制成濃度為30 mg/mL的樣品用于流變特性的測定。動(dòng)態(tài)流變的測定條件:直徑50 mm平行板,狹縫0.5 mm,應(yīng)變2%,頻率0.1 Hz。升溫速率1 ℃/min,升溫范圍20～80 ℃。

1.2.8 微觀結(jié)構(gòu)的測定 MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)用掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)測定,將制備的凝膠切成5 mm厚的小塊,用3%的戊二醛固定2 h,之后用緩沖液(0.1 mol/L KH2PO4,pH6.0)清洗1 h,再進(jìn)行不同梯度的乙醇脫水(50%、70%、90%、95%、100%),每次30 min,再用叔丁醇置換3次,-20 ℃預(yù)凍2 d,-70 ℃冷凍干燥72 h,噴金鍍膜后用SEM觀察微觀結(jié)構(gòu),加速電壓15 kV。

1.2.9 質(zhì)構(gòu)特性的測定 方法參考楊玉玲等[14],MP凝膠的硬度采用質(zhì)構(gòu)儀的TPA(Texture profile analyse,TPA)法測定。參數(shù)設(shè)置如下:選用P/6探頭,測試前速度5 mm/s,測試中速度1 mm/s,測試后速度5 mm/s,探頭深入距離為5 mm。每個(gè)樣品共3個(gè)重復(fù)。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)三次重復(fù)。用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析,如果方差分析效應(yīng)顯著,使用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對MP粒徑的影響

如圖1所示,超聲處理后,MP的平均粒徑整體顯著降低。經(jīng)超聲波處理,MP的平均粒徑從1914.67 nm(0 W)顯著降低到980.7 nm(100 W)(p<0.05),而后隨著超聲功率的增加又緩慢降低至624.5 nm(500 W)(p<0.05)。粒徑變化主要由蛋白分子內(nèi)的交聯(lián)和聚集引起的[18]。粒徑剛開始顯著降低的原因可能是由于超聲引起的空穴效應(yīng)以及微束流效應(yīng)產(chǎn)生的物理作用打斷了MP之間的非共價(jià)鍵作用。而后隨著功率的增加,粒徑變化相對100 W時(shí)變化慢,可能是由于MP分子已經(jīng)打開,分子間的相互作用相對變?nèi)酢u等[19]指出超聲波能夠降低大豆分離蛋白的粒徑。

圖1 超聲波處理對MP粒徑的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment on particle size of MP注：不同小寫字母表示處理間 差異顯著(p<0.05);圖2～圖7同。

2.2 超聲波處理對MP表面疏水作用的影響

表面疏水性反映的是蛋白表面疏水集團(tuán)數(shù)量以及溶劑質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)。如圖2所示,隨著超聲功率的增加,MP的表面疏水性從398.63(0 W)顯著增加到772.29(500 W)(p<0.05)。這表明在超聲之前,很多疏水集團(tuán)都包埋在蛋白分子或者聚合物內(nèi)部,由于超聲波的空穴效應(yīng)和微流束作用,能夠使這些集團(tuán)暴露出來,這樣ANS就很容易與原本埋藏在分子內(nèi)部的疏水集團(tuán)結(jié)合,從而MP的表面疏水性增加。Chen等[20]有相似的報(bào)道,超聲處理后蛋白的表面疏水性顯著增加。

圖2 超聲波處理對MP表面疏水性影響Fig.2 Effect of ultrasound treatment on surface hydrophobicity of MP

2.3 超聲波處理對MP溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)之一,可以作為衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的一種方法。MP經(jīng)超聲波處理后其溶解度的變化如圖3所示,隨著超聲功率的增強(qiáng),溶解度先從8.15%(0 W)增加到12.45%(300 W)(p<0.05),而后急劇增加到15.04%(400 W)(p<0.05),最后緩慢增加到15.50%(500 W)(p>0.05)。超聲處理后平均粒徑的降低導(dǎo)致其溶解度的增加(圖3);而高強(qiáng)度的超聲波可能使不溶性蛋白增多,從而使蛋白溶解度增加緩慢。Maity等[21]提出超聲波的空穴效應(yīng)產(chǎn)生的渦旋、湍流、剪切力和高壓部分打斷了分子間疏水相互作用,使蛋白質(zhì)的溶解度提高;Wang等[15]發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的超聲波能夠使雞肉中的肌原纖維蛋白的溶解度增強(qiáng)。

2.4 超聲波處理對MP Zeta電位的影響

Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位,是表征膠體體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo),用于描述膠體顆粒之間的靜電相互作用[22-23]。如圖4所示,MP的電位全是負(fù)值,說明蛋白表面負(fù)電荷要比正電荷多,凈電荷為負(fù)電荷。不同功率的超聲處理MP的Zeta電位絕對值逐漸增大,表明蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷逐漸增加,蛋白質(zhì)展開程度增加。MP的Zeta電位絕對值在100 W內(nèi),沒有顯著變化(p>0.05),然而隨著超聲功率的增加,Zeta電位絕對值先從5.43 mV(100 W)顯著增加到7.40 mV(500 W)(p<0.05)。蛋白分子表面的電荷主要取決于其狀態(tài):分散或者聚集[24]。因此,Zeta電位絕對值增加的原因可能是超聲破壞了蛋白分子的聚集,使得蛋白表面電荷暴露出來,負(fù)電荷增多。

圖4 超聲波處理對MP Zeta電位的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment on zeta potential of MP

2.5 超聲波處理對MP動(dòng)態(tài)流變的影響

研究動(dòng)態(tài)流變主要用于在不破壞蛋白結(jié)構(gòu)的情況下測定凝膠形成的過程[25]。而流變的溫度掃描可以較好地說明蛋白在加熱形成凝膠過程中蛋白的物理變化。流變參數(shù)儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)分別反映流體的彈性和粘性大小。如圖5A所示,G′值從初始溫度升至48 ℃,這個(gè)過程表明彈性蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成,是由于溫度增加促使肌原纖維蛋白分子打開。超過48 ℃之后G′值顯著降低,這是因?yàn)殡S著溫度進(jìn)一步增加,肌球蛋白尾部開始解螺旋,從而蛋白的流動(dòng)性增強(qiáng),導(dǎo)致G′值突然降低[26]。而溫度在48 ℃時(shí),且與空白對照,當(dāng)超聲功率為200 W時(shí),G′值最大(681.2 Pa),而只有超聲功率為500 W(400.2 Pa)時(shí),G′值低于空白組(448.6 Pa)。當(dāng)溫度超過53 ℃以后,G′值又快速增加,這是因?yàn)槠涫切纬捎谰玫哪z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的溫度點(diǎn),而超聲處理200 W的G′值依然高于其他超聲處理的(包括未超聲處理的),可能是由于此時(shí)引力和斥力在最高水平上達(dá)到平衡,因此能形成更好的彈性凝膠。圖5B中G″的流變趨勢與G′相似,也說明了中強(qiáng)度的超聲處理MP(200 W),流變特性最佳。

圖5 超聲波處理對MP G′(A)和G″(B)的影響Fig.5 Effect of ultrasound treatment on storage modulus(A)and loss modulus(B)of MP

2.6 超聲波處理對MP微觀結(jié)構(gòu)的影響

超聲波處理后的MP凝膠空間結(jié)構(gòu)與未處理的樣品相比,結(jié)構(gòu)變得更加致密均勻,網(wǎng)孔更小(圖6)。經(jīng)過超聲100 W處理后,網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)變化很多,較未處理的凝膠相比,網(wǎng)孔變小,已經(jīng)形成較好的凝膠。200 W處理后的凝膠網(wǎng)絡(luò)細(xì)膩,孔徑小且分布均勻,呈現(xiàn)蜂窩狀膠束,蛋白分子間的相互作用達(dá)到較好的平衡。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到300 W及以上時(shí),靜電斥力與疏水相互作用之間的平衡遭到破壞,致使其均勻的凝膠結(jié)構(gòu)遭到破壞,凝膠網(wǎng)孔變大,且不均勻,蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得粗糙。

圖6 超聲波處理對MP凝膠微觀 結(jié)構(gòu)的影響(電鏡照片2000×)Fig.6 Effect of ultrasound treatment on microstructure(SEM micrographs at 2000×)of MP gel

2.7 超聲波處理對MP質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)特性是反映MP凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要參數(shù)。如圖7所示,隨著超聲功率的增加,MP凝膠的硬度從30.10 g(0 W)快速升至51.40 g(200 W),而后逐漸降至49.40 g(500 W)(p<0.05),這表明低強(qiáng)度超聲波處理(0～200 W)可以顯著增強(qiáng)凝膠的硬度(p<0.05),可能是由于低強(qiáng)度的超聲能使MP分子打開,內(nèi)部的疏水集團(tuán)暴露出來(圖2),當(dāng)加熱成凝膠時(shí),暴露出的疏水集團(tuán)使得蛋白質(zhì)分子間的距離縮短,從而增加了蛋白質(zhì)之間凝集的機(jī)會(huì),凝膠中交聯(lián)結(jié)合的更加緊密從而增強(qiáng)了凝膠的硬度。另外,圖5中流變特性在200 W時(shí)也是最好的。而超聲處理200 W后,凝膠網(wǎng)絡(luò)孔洞更小且更加致密,有利于增強(qiáng)凝膠的硬度(圖6)。Zhao等[27]也得出了相似的結(jié)論,低強(qiáng)度的超聲波能夠使蛋白的硬度增加。當(dāng)超聲功率 ≥200 W,反而會(huì)降低凝膠的硬度,這可能是因?yàn)槌暡ǖ目昭ㄐ?yīng)以及微束流能夠破壞蛋白分子間的作用力,分子間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)遭到破壞,凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑變得粗大(圖6)。由此可知,超聲功率為200 W時(shí),MP凝膠強(qiáng)度最強(qiáng)。

圖7 超聲波處理對MP凝膠硬度的影響Fig.7 Effect of ultrasound treatment on hardness of MP gel

2.8 相關(guān)性分析

由表1可知,超聲波功率與MP的理化特性(溶解度,電位,表面疏水性)極顯著相關(guān)(p<0.01),與粒徑顯著相關(guān)(p<0.05),和硬度相關(guān)性不大(p>0.05),因此超聲波對MP的理化特性有顯著的影響;而MP凝膠硬度與電位不太相關(guān)(p>0.05),與粒徑顯著負(fù)相關(guān),與溶解度和表面疏水性顯著正相關(guān)(p<0.05),相關(guān)系數(shù)分別為-0.890,0.814和0.813。超聲波處理降低了蛋白粒徑,導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)改變,最終影響了凝膠的性質(zhì),Madadlou等[28]指出對蛋白粒徑的減少后,再重新聚合可以使其結(jié)合更緊密,空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,凝膠強(qiáng)度更強(qiáng)。與溶解度相關(guān)可能也是因?yàn)榱降母淖儭Ｊ杷嗷プ饔檬怯绊懩z強(qiáng)度的作用力之一,而靜電斥力卻不是。

表1 超聲波與MP理化特性以及凝膠強(qiáng)度之間的相關(guān)性Table 1 Correlation of ultrasound,physicochemical property of MP and strengh of MP gel

3 結(jié)論

超聲波能夠顯著影響MP的理化特性(粒徑、溶解度、Zeta電位和表面疏水性)與流變特性。低場強(qiáng)的超聲波處理(0～200 W)促進(jìn)肌原纖維蛋白適度展開,顯著降低MP的粒徑,提高其溶解度,疏水相互作用以及靜電斥力,改變其流變特性并使硬度逐漸增加。在超聲功率200 W時(shí),蛋白分子進(jìn)一步打開,此時(shí)大部分MP分子都還處于天然狀態(tài),當(dāng)加熱成膠時(shí),MP展開的速度比聚集的速度快,此時(shí)其引力和斥力在最高水平上達(dá)到平衡,致使凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加均勻、致密,凝膠硬度最大。而高強(qiáng)度超聲波處理后(300～500 W),G′、G″值和凝膠硬度都相對降低。

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