枸杞硒多糖的合成及對人體肝癌HepG2細胞增殖的體外抑制作用評價

李梅林,杜津昊,劉建飛,邸多隆,*,劉曉風,*

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050; 2.中國科學院蘭州化學物理研究所,中國科學院西北特色植物資源化學 重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

枸杞子是茄科植物枸杞(LyciumbarbartumL.)的干燥成熟果實,不僅是我國傳統的名貴中藥材,也是《中華人民共和國食品衛生法(試行)》中第一批被批準為藥食同源的物品之一,已有2000多年的食用、藥用歷史,被歷版的《中國藥典》所收載。現代藥理學表明,枸杞多糖(LBP)是枸杞的主要活性成分,具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤及抗心血管疾病等多種藥理作用[1]。尤其是抗腫瘤活性,受到眾多學者的廣泛關注。

硒是人體必需的微量元素,具有提高機體免疫力、抗衰老、拮抗有害重金屬和防止心腦血管疾病[2]等活性,被譽為人體微量元素中的“抗癌之王”。由于無機硒具有蓄積性毒性和致突變作用,使其應用受到了極大的限制。硒多糖作為一種有機硒化合物,使用安全且兼有硒和多糖二者的活性,成為近年來研究的熱點。將多糖制備成硒多糖,不僅能夠有效的提高硒的生物利用度,降低無機硒的毒性,而且硒與多糖活性結合,能夠更好的發揮抗腫瘤作用。目前,已經成功獲得了靈芝硒多糖[3]、香菇硒多糖[4]、螺旋藻硒多糖[5]和大蒜硒多糖[6]等,由于硒的引入,顯著提高了母體多糖的生物活性。Qiu等[7]合成了9種枸杞硒多糖,并利用L9(34)正交實驗法優化了硒化條件,生物活性評價實驗表明枸杞硒多糖能夠顯著提高自由基清除能力,并且明顯升高了小雞血液中GSH-Px和SOD的含量,降低了MDA水平;孫漢文[8]合成了一種枸杞硒多糖,并用MTT法測定了其對人宮頸癌細胞的抑制能力,結果發現與未硒化的相比,枸杞硒多糖能夠顯著抑制人宮頸癌細胞,且呈濃度依賴性。

枸杞多糖對肝癌細胞具有良好的抑制作用[9-10],我們前期的研究也證實了枸杞多糖能夠顯著抑制人體肝癌HepG2細胞的生長。硒多糖作為有機硒的重要類型,也表現出較好的抗腫瘤活性。通過以上綜述內容的分析,未見枸杞硒多糖抑制肝癌細胞增殖的研究。基于此,本實驗采用HNO3-Na2SeO3方法,以高純度枸杞多糖和亞硒酸鈉為原料合成一系列枸杞硒多糖,并用響應面法優化反應條件,MTT法評價枸杞硒多糖對肝癌細胞HepG2的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞(干燥品) 購于寧夏回族自治區中寧縣,經蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定為茄科植物(Solanaceae)枸杞(LyciumburbrumL.)的成熟果實;供試細胞株 人肝癌細胞HepG2為蘭大醫學院提供;MD34MM(3500 Da)透析袋 北京博奧拓達科技有限公司;硝酸、亞硒酸鈉、無水碳酸鈉、苯酚、硫酸、鹽酸 分析純,四川西隴化工有限公司;氯化鋇 分析純,天津市光復科技發展有限公司;去離子水 自制。

DF-101S型即熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;手提式多功能粉碎機 上海廣沙工貿有限公司;T6型新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;SK-2003A型原子熒光光度計 達豐瑞儀器儀表有限公司;Rotavapor R-3型旋轉蒸發儀 BUCHI公司;BSA2245-CW型分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海-恒科技術有限公司;HD2015W型電動攪拌器 上海司樂儀器有限公司;TGL-15B型離心機 上海安亭科學儀器廠;真空冷凍干燥機 賽飛中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞多糖的制備 將干燥的枸杞果實用粉碎機粉碎后過30目篩,并稱取200 g置于5000 mL圓底燒瓶中,加入乙醇200 mL,加熱回流1 h,趁熱過濾乙醇。殘渣加入蒸餾水2000 mL,120 r/min攪拌下,60 ℃提取2 h,趁熱過濾,殘渣用100 mL熱水洗滌,合并濾液和洗滌液,用旋轉蒸發儀將枸杞提取液濃縮至500 mL,在均勻攪拌下,緩慢加入95%乙醇使其溶液的最終乙醇濃度為75%,靜置6 h。待固液完全分層后,沉淀用400 mL蒸餾水復溶,再次醇沉到乙醇濃度為75%。重復此步驟2次,將得到的沉淀用丙酮洗滌,冷凍干燥即得枸杞粗多糖[11]。

將枸杞粗多糖配成1 g/20 mL的溶液,加入1/3體積Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1),離心后分層,分去有機層,棄去兩相交界處蛋白。如此反復,直到分層后兩相交界處無蛋白為止。將脫蛋白所得多糖溶液,用濃氨水調節pH,使溶液的pH為8.0～9.0,置于50 ℃水浴中,邊攪拌邊加入過氧化氫直至溶液的顏色與脫色前相比變淺后,10000 r/min離心5 min,去沉淀[12]。置于3500 Da的透析袋透析2 d,冷凍干燥得到白色絮狀固體粉末,即枸杞多糖(LBP,Lyciumbarbarumpolysaccharide)。

1.2.2 枸杞硒多糖的制備 稱取制備的LBP 1 g,置于三口燒瓶中,加入1% HNO3溶液200 mL,使LBP充分溶解。分別加入Na2SeO3和BaCl2各1 g,120 r/min攪拌下緩慢升溫至所需設定反應溫度,繼續攪拌反應至設定時間,停止反應。反應結束后冷卻至室溫,用飽和Na2CO3溶液調節pH至5～6,加入Na2SO3除去Ba2+,10000 r/min離心5 min,取上清液,用3500 Da透析袋自來水透析2 d,蒸餾水透析1 d,濃縮冷凍干燥,得枸杞硒多糖[13-14]。

在硒多糖的制備過程中,主要影響因素是反應時間、反應溫度和硒化劑的添加量[15-16]。因此,本實驗以硒含量為評價指標,分別選擇反應時間、反應溫度和Na2SeO3加入量為考察因素,利用響應面法優化最佳工藝條件[17],響應面實驗因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface method

1.2.3 枸杞硒多糖的硒含量測定 精確稱取100 mg枸杞硒多糖樣品,用HNO3-H2O2法消解,取消解液1.0 mL于25 mL比色管中,依次加入2 mL 4 mol/L鹽酸,3 mL 1 mol/L碘化鉀,3 mL 2 mol/L乙酸鈉,2 mL 1%聚乙烯醇及1 mL 0.04%孔雀綠溶液,定容至刻度,搖勻。放置40 min后,在波長670 nm測定吸光度值,根據硒標準曲線計算樣品硒的含量[13]。

1.2.4 枸杞硒多糖的結構表征 稱取5 mg枸杞多糖和枸杞硒多糖用KBr壓片,進行紅外吸收光譜測定,測定范圍為400～4000 cm-1[18]。

1.3 MTT實驗

根據最大溶解度并參照文獻中測定腫瘤細胞抑制率的方法[19],預實驗確定枸杞硒多糖Se-LBP1～Se-LBP17最佳抑制HepG2細胞濃度為160 μg/mL。本實驗用MTT法檢測枸杞硒多糖對人肝癌細胞HepG2體外生長抑制作用。將腫瘤細胞懸液以5×104細胞/每孔接種到96孔板中,待細胞80%融合后,加入160 μg/mL枸杞硒多糖溶液,培養4 h后,每孔加入50 μL MTT溶液。培養4 h后,再加入150 μL的DMSO,振蕩10 min,使用酶標儀在570 nm 波長下測定各孔OD值。根據以下公式計算抑制率:

1.4 數據統計分析

采用Excel對數據進行處理和繪圖,響應面實驗采用Design-Expert V8.0軟件進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 響應面設計與結果

按照響應面實驗因素所得結果見表2。將所得實驗數據采用Design-Expert V8軟件進行多元回歸擬合,得枸杞硒多糖硒含量對反應時間(A)、反應溫度(B)、Na2SeO3加入量(C)的二次多項回歸方程:

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Results and design of response surface method

Y=636.53+54.47A+15.46B+11.07C+8.20AB-3.46AC-2.69BC-61.35A2-39.01B2-28.35C2

由表3可知,模型F值為60.74,p<0.0001,表明響應面回歸模型達到了極顯著水平。失擬項p值=0.0532>0.05,表示實驗失擬不顯著,模型的決定系數R2=0.9874,說明該回歸模型能解釋98.74%響應值的變化,可以分析和預測此模型對枸杞多糖硒化的優化。由回歸模型和方差分析可知,方程一次項A、B,方程二次項A2、B2、C2對枸杞多糖的硒化影響達到極顯著水平(p<0.01);方程一次項C對枸杞多糖的硒化的影響達到顯著水平(p<0.05),交互項AB、AC、BC對枸杞多糖的硒化的影響不顯著(p>0.05)。根據F值可知,各個因素對枸杞多糖的硒化影響的大小順序為:反應時間(A)>反應溫度(B)>Na2SeO3加入量(C)[20]。

表3 回歸模型和方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

圖1～圖3為所得的響應面及其等高線圖,響應面圖是響應值對各因子A、B、C所構成的三維空間曲面圖,從分析圖上能比較直觀和形象的看出最佳因素參數及各因素之間的交互作用。各因素交互作用對枸杞多糖的硒化影響的大小分別為反應時間(A)>反應溫度(B)>Na2SeO3加入量(C)。響應面圖均為開口向下的凹形曲面,且相應的等高線圖呈明顯的橢圓形,說明兩因素之間交互作用較顯著,若呈圓形說明兩因素交互作用不顯著。最小橢圓的中心在所選三個因素水平的范圍之內,說明響應值(硒含量)在其范圍內存在最大值[21]。

圖1 反應時間和反應溫度對枸杞硒多糖硒含量的等高線和響應面Fig.1 The contour and response surface of reaction time and reaction temperature in selenium-containing Lycium barbarum polysaccharides

圖2 反應溫度和Na2SeO3加入量量對枸杞硒多糖硒含量的等高線和響應面Fig.2 The contour and response surface of reaction temperature and sodium selenite addition selenium in selenium-containing Lycium barbarum polysaccharides

圖3 反應時間和Na2SeO3加入量對枸杞硒多糖硒含量的等高線和響應面Fig.3 The contour and response surface of reaction time and sodium selenite addition to selenium in selenium-containing Lycium barbarum polysaccharides

經過Design-Expert軟件計算,結果表明:反應時間(A)>反應溫度(B)>Na2SeO3加入量(C),理論上分別取8.89 h、74 ℃、0.62 g時,可得理論上的最大硒含量得率為651.46 μg/g。結合實際操作條件修正反應時間A為9 h、反應溫度B為74 ℃、Na2SeO3加入量C為0.62 g,做三次平行得實際硒含量為:648.65 μg/g。由此可見真實值與回歸方程所預測值相差也不大,表明響應面優化的研究是合理可行的[22]。

2.2 FT-IR結果分析

圖4 枸杞多糖及枸杞硒多糖的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of LBP and Se-LBP

2.3 枸杞硒多糖對人肝癌細胞HepG2的抑制作用

將160 μg/mL的枸杞多糖和枸杞硒多糖作用于HepG2肝癌細胞,作用時間為24 h,結果見圖5。由圖5可知,枸杞多糖和枸杞硒多糖對HepG2細胞均有一定的抑制作用,其中,枸杞多糖作用24 h后對腫瘤細胞HepG2的抑制率為22%左右,而所有枸杞硒多糖的抑制作用明顯高于枸杞多糖,并且Se-LBP4組,即硒含量最高組對腫瘤細胞HepG2的抑制率最明顯,抑制率為38.15%,與枸杞多糖組比較,有明顯差異性(p<0.05)。同時,和低硒含量組(Se-LBP10)比較,也有統計學意義(p<0.05)。枸杞硒多糖中硒含量的大小順序與其對HepG2細胞的抑制作用強弱順序相同,均為:Se-LBP4>Se-LBP7>Se-LBP11>Se-LBP3≥Se-LBP8≥Se-LBP2>Se-LBP12≥Se-LBP16>Se-LBP13>Se-LBP6>Se-LBP1≥Se-LBP15>Se-LBP10,說明枸杞硒多糖抑制HepG2增殖能力與其硒的含量呈正相關。此外,枸杞多糖和枸杞硒多糖對HepG2細胞抑制作用具有可重復性(表4)。

表4 枸杞硒多糖對HepG2細胞抑制作用(%)Table 4 The inhibitory effect of Se-LBP on HepG2 cells(%)

圖5 枸杞硒多糖對HepG2細胞增殖抑制作用Fig.5 The proliferation inhibition of different sample No. 1-14 in HepG2 cells

3 結論

人體缺硒會產生很多危害。枸杞多糖有許多藥理活性,將枸杞多糖與硒有機結合成的硒多糖不但把無機硒轉化成了有機硒,且具有毒性更低、生物利用度更高等特點,其化學結構形成了特殊的硒氧鍵,使得生物活性普遍高于多糖和硒。本研究以枸杞硒多糖的硒含量為評價指標,利用響應面法分別考察反應時間、反應溫度和Na2SeO3加入量對硒含量的影響,結果表明:各因素的影響效果依次為反應時間>反應溫度>Na2SeO3加入量。最佳制備條件為:按照LBP為1 g計算,加入0.62 g Na2SeO3,用1%HNO3充分溶解,再加入BaCl21 g,74 ℃反應9 h。在該優化條件下,枸杞硒多糖的硒含量為648.65 μg/g。在此基礎上,利用MTT法評價枸杞硒多糖對HepG2人肝癌細胞的抑制作用,結果表明枸杞多糖和枸杞硒多糖對HepG2細胞均有一定的抑制作用,所有枸杞硒多糖的抑制作用明顯高于枸杞多糖,并且硒含量最高的Se-LBP4組對腫瘤細胞HepG2的抑制率最明顯,抑制率為38.15%,與枸杞多糖組和低硒含量枸杞硒多糖組比較,均有明顯差異性(p<0.05)。同時,枸杞硒多糖中硒含量的大小順序與其對HepG2細胞的抑制作用強弱順序相同,均為:Se-LBP4>Se-LBP7>Se-LBP11>Se-LBP3≥Se-LBP8≥Se-LBP2>Se-LBP12≥Se-LBP16>Se-LBP13>Se-LBP6>Se-LBP1≥Se-LBP15>Se-LBP10,說明枸杞硒多糖抑制HepG2增殖能力與其硒的含量呈正相關。將無機硒轉化為有機硒的同時,也為今后硒化枸杞多糖開發成藥物或保健食品奠定了基礎。但其硒化多糖抑制腫瘤細胞的作用機制尚不清楚,安全性評價有待進一步研究。

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