超高壓輔助制備老蒜提取物工藝研究

劉 暢,劉 銳,3,吳 濤,3,張 民,3,*

(1.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室,天津 300457; 2.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457； 3.天津食品安全低碳制造協同創新中心,天津 300457)

大蒜(Allium Sativum)為百合科蔥屬植物生蒜的地下鱗莖,原產于西亞和中亞一帶,世界各國均有分布[1-2]。我國大蒜資源豐富,據統計,日本和東南亞市場上80%的大蒜來自我國[3]。現代醫學研究表明,大蒜具有豐富的生物活性功能,如抗氧化、預防心血管疾病、增強免疫功能、抑菌、抗腫瘤、預防糖尿病、保護肝臟等[4-6]。老蒜提取物(AGE)作為一種大蒜精深加工產品,具有良好的抗氧化能力,對糖尿病、動脈粥樣硬化、老年癡呆癥等疾病的預防等具有積極作用[7-9];而且相對其它大蒜制品,AGE刺激性低,即使高劑量使用也是無害的,具有良好的食用安全性,可用于膳食補充劑,已得到國內外廣泛關注。

目前,AGE生產普遍采用Wakunaga制藥有限公司建立的工藝,具體是將新鮮大蒜蒜片在室溫下用15%～25%的乙醇水溶液浸泡10個月或者20個月以上,過濾后的浸提液經減壓低溫濃縮后得到AGE[10],符合商業老蒜提取物中SAC含量為1.6～2.4 g/kg(干重)的標準[11]。但該方法存在生產周期較長的問題,同時乙醇濃度較高,生產成本也隨之增加。本課題組[12]前期研究制備了兩種老蒜提取物,一種是將新鮮大蒜去皮、切片后,以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于乙醇濃度為10%(v/v)的溶液中,室溫條件下避光浸泡90 d后濃縮所得,其SAC含量為1.6 g/kg(干重);另一種是將新鮮大蒜去皮、切片后以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于蒸餾水中,室溫條件下避光浸泡20 d濃縮所得,其SAC含量為1.8 g/kg(干重)。上述方法均為直接溶劑浸提法,顯著縮短了生產周期,同時降低了乙醇溶液濃度。

為了進一步優化老蒜提取物生產工藝,本文擬采用超高壓輔助浸提法,研究不同超高壓處理條件對老蒜提取物的抗氧化活性的影響,結合老蒜提取物制備過程中主要功能成分含量的變化,考察浸泡時間對老蒜提取物制備的影響,確定一種超高壓輔助制備老蒜提取物的工藝方法,旨在縮短生產周期,降低乙醇溶液濃度或提高SAC活性成分含量,從而為老蒜產品的研究與開發提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通白皮大蒜 山東萊蕪;濃硫酸、濃鹽酸 天津國藥集團有限公司;無水乙醇 天津市江天化工技術有限公司;甲醇 天津市康科德科技有限公司 色譜純;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪 美國Sigma公司;蒜氨酸標準品、S-烯丙基半胱氨酸標準品 美國Fluka公司,≥90%;無特殊說明均為分析純試劑。

HPP.L2-600/0.6超高壓設備 天津華泰森淼生物工程技術有限公司;TU-1810 PC型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;LC-20AT高效液相色譜儀泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓輔助制備大蒜提取物 將新鮮大蒜去皮、切片,按一定料液比立即浸泡于一定濃度的乙醇溶液中,在室溫條件下進行超高壓處理,超高壓處理后的液體溶液經定性濾紙常壓過濾后即為目標大蒜提取物,通過測定大蒜提取物的DPPH·清除率、·OH清除率、總抗氧化能力等確定提取條件[13-14],分別考察超高壓處理壓力(100、200、300、400、500、600 MPa)、保壓時間(1、3、5、7、9、11 min)、乙醇濃度(0%、10%、20%、30%、40%,均為v/v)、料液比(1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15 g·mL-1)對浸提液抗氧化活性的影響,固定的因素及水平為：處理溫度為室溫，超高壓處理壓力為300 MPa，保壓時間為30 min,乙醇濃度為10%，料液比為1∶6 g·mL-1。

1.2.2 老蒜提取物的制備 結合大蒜提取物超高壓單因素實驗結果,考察浸泡時間對老蒜提取物制備過程中抗氧化活性的影響,配制相同濃度(0.024 mg/mL)抗壞血酸溶液作為對照,以浸提液抗氧化測定數據占抗壞血酸溶液測定數據比例為結果。以處理壓力200、300、400 MPa,保壓時間5 min,料液比1∶9 g·mL-1,乙醇濃度10%(v/v)作為處理條件,并以未經超高壓處理直接浸泡作為對照,每隔5 d取樣,分別測定DPPH·清除率、·OH清除率、總抗氧化能力等抗氧化活性,S-烯丙基半胱氨酸、S-烯丙基半胱氨酸亞砜、總糖等功能成分含量,從而確定浸泡時間。

1.2.3 DPPH·清除率實驗 配制0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:準確稱取7.89 mg DPPH溶于少量無水乙醇中,定容至100 mL,即得。各組加樣分別為:吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為Ac;吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為As;吸取3.0 mL無水乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為Ab。室溫避光反應20 min,于517 nm處測定各組吸光度值,每組樣品測定3個平行[15]。根據下列公式計算得到清除率。

DPPH·清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

1.2.4 ·OH清除率實驗 采用Fenton反應體系,·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2體系產生。由于·OH可特異性地使番紅花紅T褪色,可根據番紅花紅T褪色程度用比色法測定·OH清除率。分別配制pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液,1 mmol/L番紅花紅T溶液,4 mmol/L硫酸亞鐵溶液、4 mmol/L EDTA-2Na溶液,3% H2O2溶液。將4 mmol/L EDTA-2Na溶液和4 mmol/L硫酸亞鐵溶液等體積混合得到2 mmol/L EDTA-Fe儲備液。各組分別按照順序加樣:2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3%H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL樣品溶劑,記為A0;2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL蒸餾水,2.0 mL樣品溶劑,記為Ai;2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL樣品溶液,記為A。將各組混合均勻后,在37 ℃條件下水浴30 min,于520 nm處測定吸光度值,每組樣品測定3個平行。根據下列公式計算得到清除率。

·OH清除率(%)=((A-A0)/(Ai-A0))×100

1.2.5 總抗氧化能力測定 采用FRAP法測定總抗氧化能力[15]。分別配制0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液,40 mmol/L鹽酸溶液,20 mmol/L氯化鐵溶液,10 mmol/L TPTZ溶液;再以10∶1∶1的體積比取0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液,20 mmol/L氯化鐵溶液,10 mmol/L TPTZ溶液均勻混合,得到FRAP工作液,使用前放置于37 ℃水浴中保溫。吸取0.2 mL樣品溶液,再加入5.0 mL預熱好的FRAP工作液,混勻后室溫放置10 min,于593 nm處測定吸光度值,每組樣品3個平行。同時,配制一系列濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的FeSO4標準溶液代替樣品溶液作標準曲線,以FeSO4濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,得到標準曲線回歸方程。對應回歸方程計算出浸提液的FRAP值,從而得到樣品抗氧化能力的強弱。

1.2.6 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[17]。配制6%重蒸苯酚。準確稱取干燥至恒重的果糖10 mg,加蒸餾水定容至100 mL,得到100 μg/mL果糖對照品溶液,分別吸取果糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,各加入蒸餾水均補至2.0 mL,然后加入1.0 mL 6%重蒸苯酚,混合均勻后加入濃硫酸5.0 mL,搖勻后室溫放置20 min,于490 nm處測定吸光度值。同時以2.0 mL蒸餾水替代標準溶液按同樣顯色方法操作為空白作標準曲線,以果糖質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,得到標準曲線回歸方程。同樣方法測定樣品溶液中總糖含量。

1.2.7 S-烯丙基半胱氨酸(SAC)含量測定 采用高效液相色譜法測定SAC含量[12]。準確稱取一定質量的SAC標準品溶于色譜甲醇中,以流動相稀釋至一系列濃度為25、50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL的標準品溶液,經0.22 μm有機系濾膜過濾后進行測定。液相色譜條件為流動相V(甲醇)∶V(水)=10∶90,流速為0.8 mL/min,色譜柱為Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高壓洗脫,紫外檢測器,檢測波長220 nm,進樣量20 μL。按照上述色譜條件測定后,以峰面積積分值A為橫坐標,SAC濃度C為縱坐標,得到標準曲線回歸方程。同樣方法測定樣品溶液中SAC含量。

1.2.8 S-烯丙基半胱氨酸亞砜(SACS)含量測定 采用高效液相色譜法測定SACS含量[3]。準確稱取一定質量的SACS標準品溶于色譜甲醇中,以流動相稀釋至一系列濃度為90、150、225、300、450、600、750 μg/mL的標準品溶液,經0.22 μm有機系濾膜過濾后進行測定。液相色譜條件為流動相V(甲醇)∶V(水)=20∶80,流速為0.8 mL/min,色譜柱為Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高壓洗脫,紫外檢測器,檢測波長214 nm,進樣量20 μL。按照上述色譜條件測定后,以峰面積積分值A為橫坐標,SACS濃度C為縱坐標,得到標準曲線回歸方程。同樣方法測定樣品溶液中SACS含量。

1.3 數據統計分析

實驗數據均用平均數±標準差的形式表示,使用origin 8.5進行數據處理作圖,實驗數據組間比較采用One-way ANOVA進行顯著性分析,p<0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 超高壓輔助制備老蒜提取物處理條件的確定

2.1.1 超高壓處理壓力對浸提液抗氧化活性的影響 由表1可知,隨著超高壓處理壓力的增加,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及總抗氧化能力均呈先上升后下降的趨勢。當處理壓力為300 MPa時,DPPH·清除率最高,可達到89.50%;·OH清除率在較低處理壓力具有較高的清除率,當處理壓力為100 MPa時,·OH清除率最高為80.67%;而浸提液總抗氧化能力與DPPH·清除率結果一致,當處理壓力為300 MPa時最高,FRAP值達到0.534 mmol/L。結果表明,經過超高壓處理后,浸提液抗氧化活性均較未處理樣品明顯提高,不同處理壓力對浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及總抗氧化能力等抗氧化活性影響程度不同。

表1 處理壓力對浸提液抗氧化活性的影響Table 1 Effect of treatment pressure on the antioxidant activities of extracts

綜合分析超高壓處理壓力對浸提液抗氧化活性結果可知,浸提液DPPH·清除率與總抗氧化能力的變化趨勢一致,均在300 MPa下為最優,而·OH清除率隨處理壓力變化規律不明顯,無法確定最優的超高壓處理壓力。因此,選取DPPH·清除率和總抗氧化能力均較高的處理壓力200、300和400 MPa,在隨后考察浸泡時間對老蒜提取物產品影響時,進一步以老蒜提取物中SAC含量為指標,確定超高壓處理壓力最優條件。

2.1.2 超高壓保壓時間對浸提液抗氧化活性的影響 由表2可知,隨著保壓時間的延長,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均呈波動變化,當保壓時間為5 min時,DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均處于較高水平,分別為87.13%、80.44%和0.239 mmol/L。因此,最佳保壓時間5 min作為處理條件。與不同超高壓處理壓力結果一致,經過超高壓處理后,浸提液抗氧化活性均較未處理樣品明顯提高。

表2 保壓時間對浸提液抗氧化活性的影響Table 2 Effect of holding time on the antioxidant activities of extracts

2.1.3 乙醇濃度對浸提液抗氧化活性的影響 由表3可知,隨著乙醇濃度的增大,浸提液DPPH·清除率和總抗氧化能力均呈現先上升后下降的趨勢,當乙醇濃度10% 時,DPPH·清除率和FRAP值分別可達到85.59%和0.227 mmol/L;浸提液·OH清除率隨乙醇濃度的增大呈下降的趨勢,蒸餾水作為浸提溶劑時,·OH清除率為37.74%。結果表明,較高的乙醇濃度會使浸提液抗氧化活性降低。然而,根據課題組前期研究結果,當采用蒸餾水作為溶劑進行老蒜提取物制備時,雖然SAC含量有所上升,但SACS含量較乙醇溶液作為浸提液時有所降低[12]。綜合上述結果,選擇10%乙醇溶液作為浸提溶劑。此時,浸提液各項抗氧化活性指標均處于較高水平。

表3 乙醇濃度對浸提液抗氧化活性的影響Table 3 Effect of ethanol concentration on the antioxidant activities of extracts

2.1.4 料液比對浸提液抗氧化活性的影響 由表4可知,隨著料液比的逐漸增大,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均呈現先上升后下降的趨勢。當料液比為1∶9 g·mL-1時,DPPH·清除率、·OH清除率和FRAP值均最高,分別達到68.70%,28.01%和0.119 mmol/L。結果表明,料液比對老蒜提取物抗氧化活性影響較大,隨著料液比的增大,有利于超高壓處理對活性成分的提取,這可能是由于在高壓狀態下料液比過低,體系中溶劑的流動性受到一定的束縛,從而抑制了活性成分的擴散與運動;當料液比過高時,即反應體系中底物濃度過低,會抑制γ-谷氨酰轉肽酶、蒜氨酸酶等參與的酶促反應的反應速率,同時料液比增大使得溶劑使用和后期溶劑濃縮成本提高[18]。因此,選擇料液比1∶9 g·mL-1作為處理條件。該條件下,浸提液各項抗氧化活性均處于較高水平。

表4 料液比對浸提液抗氧化活性的影響Table 4 Effect of solid to liquid radio on the antioxidant activities of extracts

2.2 浸泡時間對老蒜提取物性質的影響及浸泡時間的確定

2.2.1 浸泡時間對老蒜提取物抗氧化活性的影響 由圖1可知,隨著浸泡時間的延長,各組浸提液DPPH·清除率在前20 d顯著下降,隨后趨于平緩,并且經200 MPa處理的浸提液DPPH·清除率高于其它處理壓力下的各組浸提液;由圖2、圖3知，各組浸提液·OH清除率和總抗氧化能力隨浸泡時間的延長波動較大。結果表明,在蒜老化的過程中,通過酶促和化學反應自然產生了很多中間化合物,而這些化合物隨著浸泡時間的延長不斷進行轉化最終形成老蒜提取物活性成分SAC和其它揮發性丙基硫化物,這些化合物對浸泡過程中抗氧化活性起到重要的影響,但目前機理尚未完全明確[19]。

圖1 不同處理條件下老蒜提取物的DPPH·清除率Fig.1 DPPH· scavenging rate of AGE with different treatment conditions

圖2 不同處理條件下老蒜提取物的·OH清除率Fig.2 ·OH scavenging rate of AGE with different treatment conditions

圖3 不同處理條件下老蒜提取物的總抗氧化能力Fig.3 FRAP value of AGE with different treatment conditions

2.2.2 浸泡時間對老蒜提取物功能成分含量的影響 考察浸泡時間對老蒜提取物制備過程中功能成分含量的影響,測定結果如圖4～圖6。由圖4可知,隨著浸泡時間的延長,各組浸提液總糖含量呈先上升后下降的趨勢,且經200 MPa處理后的樣品在較多時間點高于其他組樣品,且在55 d時達到較高值。由圖5可知,隨著浸泡時間的延長,200、300 MPa與未處理組浸提液SAC含量呈先上升后趨于平緩的趨勢,而400 MPa條件下基本無明顯上升趨勢且含量較低,其中200 MPa條件下SAC含量上升最為明顯,且在較多時間點高于其他組樣品,并在55 d時達到較高值,這與文獻報道中隨著浸泡時間的延長,AGE中S-烯丙基半胱氨酸等水溶性有機化合物含量增加的結果一致[20]。由圖6可知,隨著浸泡時間的延長,各組浸提液SACS含量呈逐漸上升的趨勢,且經400 MPa處理后的樣品在較多時間點高于其他組樣品,這可能是由于較高的壓力使γ-谷氨酰轉肽酶的酶活性降低,γ-谷氨酰半胱氨酸更多地通過氧化水解轉化為SACS,而不利于轉化為SAC[21]。綜合考慮浸泡時間對老蒜提取物制備過程的影響,且由于商業老蒜提取物以SAC含量為指標,因此,確定200 MPa,浸泡時間55 d為處理條件。在該處理條件下,AGE產品中SAC含量為123.2 mg/L,換算為干重為1.9 g/kg,符合商業老蒜提取物中SAC含量為1.6～2.4 g/kg(干重)的標準[11]。

圖4 不同處理條件下老蒜提取物的總糖含量Fig.4 Fructose content in AGE with different treatment conditions

圖5 不同處理條件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸含量Fig.5 SAC content in AGE with different treatment conditions

圖6 不同處理條件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸亞砜含量Fig.6 SACS content in AGE with different treatment conditions

3 結論

通過研究超高壓處理條件對浸提液抗氧化活性及測定老蒜提取物制備過程中浸泡時間對浸提液性質的影響,確定超高壓輔助制備老蒜提取物的最佳條件為：將新鮮大蒜去皮切片后,以料液比為1∶9 g·mL-1浸泡于10%的乙醇溶液中,于室溫條件下進行超高壓處理,處理條件為壓力200 MPa,保壓時間5 min,再于室溫條件下避光保存55 d后制得老蒜提取物。該方法制得的AGE中SAC含量為1.9 g/kg(干重),符合商業老蒜提取物中SAC含量標準。因此,采用超高壓輔助制備老蒜提取物,不僅極大地縮短了溶劑浸泡制得老蒜提取物備的工藝周期,而且為老蒜產品的研究與開發提供理論依據。

[1]高立,陳磊,郭巖.大蒜極其有效成分對降低心血管疾病和癌癥發病中的重要作用研究[J].菏澤醫學專科學校學報,2007,19(2):83-85.

[2]張柯,張浩玉.大蒜的功能性成分及保健功能[J].廣西輕工業,2010(9):3-4.

[3]張民,陳倩娟,劉玉柱,等. HPLC法測定大蒜中蒜氨酸和大蒜素的含量[J].食品與發酵工業,2009,35(2):156-158.

[4]Weiss N,Papatheodorou L,Morihara N,et al.Aged garlic extract restores nitric oxide bioavailability in cultured human endothelial cells even under conditions of homocysteine elevation[J]. Journal of Ethnopharmacology,2013,145(1):162-167.

[5]Golovchenko I,Yang C,Goalstone M L,et al.Garlic extract methylallyl thiosulfinate blocks insulin potentiation of platelet-derived growth factor-stimulated migration of vascular smooth muscle cells[J]. Metabolism,2003,52(2):254-259

[6]王利華.大蒜的營養保健功能及加工利用[J].中國食物與營養,2006(4):25-27.

[7]Dillon S A,Burmi R S,Lowe G M,et al.Antioxidant properties of aged garlic extract:aninvitrostudy incorporating human low density lipoprotein[J]. Life Sciences,2003,72(14):1583-1594.

[8]張曉林,劉萍.大蒜有機硫化物的研究進展[J].醫學綜述,2011,17(3):432-434.

[9]Chauhan N B,Sandoval J.Amelioration of early cognitive deficits by aged garlic extract in Alzheimer’s transgenic mice[J].Phytotherapy Research,2007,21(7):629-640.

[10]Khalil A M,Yasuda M,Farid A S,et al.Immunomodulatory and antiparasitic effects of garlic extract on Eimeria vermiformis-infected mice[J]. Parasitology Research,2015,114:2735-2742.

[11]Morihara N,Hayama M,Fujii H.Aged garlic extract scavenges superoxide radicals[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2011,66(1):17-21.

[12]王小敏,楊鈺昆,張民.老蒜提取物制作工藝及其功能成分變化研究[J].食品安全質量檢測學報,2015,6(2):659-666.

[13]Wang X,Yang Y,Liu R. Identification of antioxidants in aged garlic extract by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry[J]. International Journal of Food Properties,2016,19:474-483.

[14]Wang X,Liu R,Yang Y. Isolation,purification and identification of antioxidants in an aqueous aged garlic extract[J].Food Chemistry,2015,187:37-43.

[15]Fu L,Chen H,Dong P,et al.Effects of ultrasonic treatment on the physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from mushroomInonotusobliquus[J]. Journal of Food Science,2010,75(4):322-327.

[16]趙文恩,李茜倩. FRAP法測定大棗棗皮紅色素的總抗氧化能力[J].鄭州大學學報：工學版,2011,32(3):28-30,35.

[17]周振,周能.苯酚-硫酸法測定仁東大蒜中的總糖[J].食品研究與開發,2012,33(6):137-142.

[18]盛小波.超高壓處理對牛乳清蛋白水解及其產物抗氧化活性的影響[D].北京：中國農業科學院,2011.

[19]Colín-González A L,Santana R A,Silva-Islas C A,et al. The antioxidant mechanisms underlying the aged garlic extract-and s-allylcysteine-induced protection[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2012(3):907162.

[20]Kodera Y,Suzuki A,Imada O,et al. Physical,chemical,and biological properties of S-allylcysteine,an amino acid derived from garlic[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(3):622-632.

[21]Zhang M,Lei N,Zhu T,et al.Thermal processing effects on the chemical constituent and antioxidant activity of s-alk(en)ylcysteine s-oxides(alliin)extract[J]. LWT-Food Science and Technology,2013,51(1):309-313.