不同種類可同化氮素對黃酒酵母產高級醇能力的影響

李智慧,金建順,唐雅鳳,劉雙平,3,周志磊,毛 健,4,*

(1.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122; 2.會稽山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000; 3.江蘇省產業技術研究院食品生物技術研究所(如皋江大食品生物 技術研究所有限公司),江蘇南通 226500; 4.江南大學(如皋)食品生物技術研究所,江蘇如皋 226500)

高級醇又稱作雜醇油,是黃酒釀造中不可避免的副產物。高級醇以異丙醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇為主[1]。高級醇是構成黃酒風味的主要成分,適量的高級醇可使酒體豐滿圓潤、口感柔和協調;黃酒中高級醇含量過高,除飲用時會覺有異雜味外,還會產生較強的致醉性[2]。

可同化氮素是指在酒精發酵中酵母優先利用的氮素,包括無機氮(銨態氮等)、有機氮(游離α-氨基酸和小分子多肽等)[3]。可同化氮素與高級醇的形成密切相關,在發酵液中添加可同化氮素會對發酵產物中高級醇的最終形成產生很大的影響[4]。苑振宇等[5]研究表明隨著不斷增加碳酸氫銨的添加量,高級醇生成量逐步減少。HERNáNNDEZ-ORTE P等[6]結果表明,高級醇的含量隨著硫酸銨的添加降低,發酵前向合成培養基中添加硫酸銨,高級醇含量降低的效果更加明顯。Manuel M Losada等[7]表明可同化氮素的添加對高級醇、乳酸乙酯有重要影響。徐姍娜等[8]研究結果表明,隨著增大蜂蜜酒培養基中氮素濃度,蜂蜜酒中高級醇的含量都增大。相對于添加無機氮素的蜂蜜酒,添加有機氮素的蜂蜜酒高級醇的含量更高。R N Greenshields[9]研究表明白酒釀造中,通過向發酵醪或培養基中添加氮素,高級醇(主要指異丁醇和異戊醇)明顯受到抑制,最大降低率達50%～70%。汪江波等[10]發現調整適宜的麥汁α-氨基氮是降低高級醇的重要工藝措施。甄會英等[11]研究了葡萄汁中添加亮氨酸對高級醇生成量影響最為顯著,甘氨酸對高級醇生成量基本無影響。Diego Torrea等[12]研究氮素添加結果表明,無機氮素相對于有機氮素降低高級醇更有優勢。Rubén Martínez-Moreno等[13]研究表明氮素種類的添加時間影響雜油醇的生成。Espinosa Vidal E等[14]研究表明氮素營養充足時,高級醇的生成主要是Ehrlich途徑,而氮素營養缺乏時,高級醇的生成主要是Harris途徑。T Clement等[15]根據氮素和高級醇之間的關系,通過調節氮素來調控高級醇的含量。

目前國內外研究可同化氮素添加主要集中在葡萄酒中高級醇,而不同種類可同化氮素之間,不同酒類之間研究較少,而國內外關于可同化氮素的添加對黃酒高級醇的研究也相對較少。本文通過在發酵體系中添加不同可同化氮素，對兩種釀酒廠酵酒酵母進行發酵過程中生物量、乙醇以及高級醇的含量檢測，探討不同可同化氮素對不同種類黃酒酵母的產高級醇能力的影響，以期為降低黃酒中高級醇含量提供新思路，提高黃酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母RWBL Y1739 LZH 上海某釀酒廠提供;釀酒酵母RWBL Y1615 ZC 浙江某釀酒廠提供;粳米 無錫米市;麥曲 上海某釀酒公司提供;胰蛋白胨;牛肉膏;酵母膏;葡萄糖;硫酸;無水乙醇;異丙醇;異丁醇;正戊醇;異戊醇;β-苯乙醇;2-辛醇;銨態氮(磷酸氫二銨;碳酸氫銨;硫酸銨;氯化銨;尿素);氨基氮(纈氨酸;亮氨酸;苯丙氨酸;精氨酸;谷氨酸) 國藥集團化學試劑有限公司。

RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機 無錫瑞江分析儀器有限公司;Waters e2695HPLC 沃特世科技(上海)有限公司;GC-MS 賽默飛世爾科技有限公司;SHP-250隔水式恒溫培養箱 上海雙旭電子有限公司;7230G可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;SW-CJ-1C超凈臺 上海雙旭電子有限公司;EL3002電子天平 瑞徽電子有限公司;立式壓YXQ-LS力蒸汽滅菌鍋 上海屹利科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗培養基 平板培養基(YEPD):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,瓊脂20 g/L,pH自然,115 ℃滅菌20 min。種子培養基(YPD):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,pH自然,115 ℃滅菌20 min。釀酒原料糖液:取100 g蒸熟米飯,加入400 g水和液化酶(酶活35000 CU/mL)200 μL、糖化酶(酶活500 AGU/mL)100 μL和生麥曲10 g,60 ℃水浴4 h。過濾取上清液,調節糖度為14 °Bx,進行分裝,在115 ℃殺菌20 min,作為發酵模擬液。

1.2.2 種子活化及培養 在超凈臺中將釀酒酵母菌種接種于YEPD培養基,30 ℃培養24 h;用接種環取YEPD上的單個菌落一環,接種于YPD培養基中培養,30 ℃培養24 h,200 r/min;待用。

1.2.3 可同化氮素的添加 各稱取200 mgN/L磷酸氫二銨、碳酸氫銨、硫酸銨、氯化銨、尿素、L-苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸進行氮素添加實驗,對照組不添加可同化氮素,隨同YPD中培養好酵母菌(5%)一同加入釀酒原料糖液中,在28 ℃條件下培養5 d,15 ℃條件下培養5 d。

1.2.4 酵母生長OD值的測定 取發酵過程中的不同氮源添加組,發酵時間為0、6、12、24、36、48、60、72、96 h的發酵液,適當稀釋于比色皿中,在600 nm波長條件下使用可見分光光度計進行檢測,測定其OD值,并根據測定結果,繪制生長曲線。

1.2.5 發酵結束時乙醇含量的測定 發酵結束時,取不同氮素添加組發酵液進行5000 r/min離心5 min,離心后取上清液并經0.45 μm的水系濾膜過濾,放置于樣品瓶中。采用HPLC進行乙醇含量的測定,檢測方法參照文獻[15],并略有改動。HPLC檢測條件:2414示差檢測器,色譜柱型號SH1011,柱溫50 ℃,流速1 mL/min,流動相0.01 mol/L的硫酸水溶液,進樣量10 μL。

1.2.6 發酵結束時高級醇含量測定 樣品的預處理參照文獻[16],并略有改動。將黃酒酒精度稀釋至6% vol,取6 mL稀釋后黃酒液,加到20 mL頂空瓶中,加2.5 g NaCl,30 μL內標(210 mg/L 2-辛醇)。使用50 μm PDMS萃取頭(使用前250 ℃老化30 min),50 ℃下吸附45 min,250 ℃解吸8 min,用于GC-MS測定。GC條件:色譜柱:TG-WAXMS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)。進樣口溫度:250 ℃。程序升溫:40 ℃保持3 min;6 ℃/min升溫至100 ℃;10 ℃/min升溫至230 ℃,保持7 min。載氣:高純氦氣(>99.999%),不分流,流速為1.0 mL/min。

1.3 數據處理及分析

顯著性分析采用SPSS Statistics 22.0軟件進行數據處理和分析,方差顯著性在p<0.05水平上進行ANOVA檢驗,結果以均值±標準差形式表示;其他數據采用Excel 2013、Origin 9.0處理。

2 結果與分析

2.1 不同種類可同化氮素對酵母生長的影響

可同化氮素是黃酒發酵中酵母所需的重要營養物質之一,可同化氮素含量低不僅導致酵母菌數量低,還增加發酵延緩和中止的危險性。不同可同化氮素添加條件下的酵母生長情況如圖1、圖2所示。

圖1 不同種類氮素條件下RWBL Y1739 LZH生長變化Fig.1 Growth changes of RWBL Y1739 LZH under different nitrogen conditions

圖2 不同種類氮素條件下RWBL Y1615 ZC生長變化Fig.2 Growth changes of RWBL Y1615 ZC under different nitrogen conditions

從整體結果來看,在發酵過程添加不同的可同化氮素,酵母的生長有著相同的生長趨勢,但是酵母RWBL Y1615 ZC比RWBL Y1739 LZH具有更好的漲勢,這取決于酵母自身的發酵特性。而對于RWBL Y1739 LZH,在磷酸氫二銨、碳酸氫銨、尿素條件下,酵母表現出更好的生長趨勢,其余組別無明顯差距。對于RWBL Y1615 ZC,除硫酸銨、氯化銨外,其余組別無明顯差距。分析原因可能是由于不同釀酒酵母對可同化氮素的嗜好性不同,優先利用的氮素更有利于酵母的生長。

2.2 不同種類可同化氮素對乙醇含量的影響

可同化氮素的添加,對發酵體系中釀酒酵母產乙醇的含量有著重要影響。不同種類可同化氮素條件下的發酵液中的乙醇含量如圖3、圖4所示。

圖3 不同種類氮素條件下RWBL Y1739 LZH乙醇含量Fig.3 Content of RWBL Y1739 LZH in different nitrogen conditions注:圖中不同字母之間表示差異顯著(p<0.05), 相同字母之間表示差異不顯著(p>0.05),圖4同。

圖4 不同種類氮素條件下RWBL Y1615 ZC乙醇含量Fig.4 Content of RWBL Y1615 ZC in different nitrogen conditions

由實驗結果可知,不同可同化氮素條件下酒精的產生存在著較大的差異。首先,對于兩種釀酒酵母,RWBL Y1739 LZH的乙醇產量要優于RWBL Y1615 ZC,適用于整個實驗組。其次,就RWBL Y1739 LZH發酵實驗結果(圖3)來看,隨著可同化氮素的添加,乙醇含量均呈現增加趨勢,除碳酸氫銨、纈氨酸、精氨酸外,均與對照組顯著差異(p<0.05);在磷酸氫二銨和尿素條件下,發酵結束乙醇生成量占優,遠高于對照組,與呂欣等[17]發現與尿素相比硫酸銨是較好的無機氮源,發酵終了酒精濃度最高,結論相符。而楊士春[18]研究了尿素對酒精發酵的影響,發現其對酵母菌發酵生成酒精最佳添加濃度為9.6 g/L。但是RWBL Y1615 ZC組內表現趨勢與RWBL Y1739 LZH存在差異,圖4中添加硫酸銨和尿素后乙醇呈現減少趨勢,與對照組存在顯著差異(p<0.05),這與RWBL Y1739 LZH的乙醇變化呈現相反的結果,此外就添加可同化氮素而言,RWBL Y1615 ZC乙醇含量并沒有起到提升的作用。分析其原因,可能是酵母RWBL Y1615 ZC的氮源利用嗜好性不同于RWBL Y1739 LZH。且硫酸銨與尿素的添加量抑制了乙醇的代謝,這說明酵母的生長需要適當的氮素濃度,且不同酵母利用氮素的優先順序不同,針對特定酵母菌添加優先利用的氮素,更有利于乙醇的產生。

2.3 不同種類可同化氮素對高級醇含量的影響

2.3.1 高級醇標準曲線 通過GC-MS測定結果表明,在實驗條件下異丙醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇都呈現出較好的線性關系(表1)。發酵液中高級醇在色譜圖中呈現出較好的峰型(圖5)。

表1 不同高級醇標準曲線Table 1 Standard curves of different higher alcohol

圖5 發酵液中高級醇GC-MS分析色譜圖Fig.5 GC-MS analysis chromatogram in fermentation liquid of higher alcohols

2.3.2 發酵液中不同種類高級醇含量變化 不同種類的可同化氮素是影響高級醇產量的重要因素,不同種類高級醇之間的含量變化如圖6、圖7所示。

圖6 不同種類氮素條件下RWBL Y1739 LZH各高級醇含量Fig.6 Higher alcohols content of RWBL Y1739 LZH under different nitrogen conditions

圖7 不同種類氮素條件下RWBL Y1615 ZC各高級醇含量Fig.7 Higher alcohols content of RWBL Y1615 ZC under different nitrogen conditions

由圖6、圖7實驗結果可知,不同釀酒酵母產高級醇組成基本相同,對于RWBL Y1739 LZH和RWBL Y1615 ZC產異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇含量占據了高級醇的大部分,但是不同酵母發酵產生的高級醇含量存在著明顯的差異,RWBL Y1739 LZH產異戊醇高于β-苯乙醇的含量,而RWBL Y1615 ZC 產β-苯乙醇的含量高于異戊醇的含量,原因可能是RWBL Y1615 ZC的β-苯乙醇代謝途徑要強于RWBL Y1739 LZH的β-苯乙醇的代謝途徑,同樣異戊醇的代謝途徑也存在著相同的關系,與陳雙等[19]研究不同地區的酵母產β-苯乙醇具有類似的結果。添加氮素后異丙醇的產生有很大的變化,RWBL Y1739 LZH產異丙醇含量對照組(0.06 mg/L),銨鹽組(0.11～0.18 mg/L)和氨基酸組(0.06～0.08 mg/L)。而RWBL Y1615 ZC異丙醇和異戊醇并無明顯變化,這與GARDE-CERDáN T等[20]通過向氮素缺陷性菌株中添加銨鹽和不同含量的氨基酸,結果發現氨基酸的添加對高級醇含量的影響不顯著的結果一致。

由實驗結果可知,可同化銨鹽類的添加均有利于高級醇的降低,而氨基酸類的氮素添加卻表現出不同的結果,其中L-苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸的添加分別使得β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇增高,這與韓濤等[21]研究亮氨酸對高級醇生成的影響最為顯著,纈氨酸次之,甘氨酸的影響最小等結果類似。與HERNáNDEZ-ORTE P等[22]研究了可同化氮素對三種酵母菌種發酵的影響,銨態氮添加使異戊醇的含量降低,氨基酸的添加顯著增大了葡萄酒中異丁醇的含量結果相符。LOSADA M M等[7]研究發現隨著向葡萄汁中添加的銨鹽或氨基酸含量的增加,異戊醇的含量顯著降低,也存在相似的結果。

2.3.3 發酵液中總高級醇含量變化 在發酵過程中可同化氮素的添加,對釀酒酵母產高級醇有著重要的影響。不同種類的可同化氮素對總高級醇產生的影響如表2所示。

表2 不同種類可同化氮素條件下高級醇總量Table 2 Total high alcohol under different kinds of assimilation nitrogen

由表2可知,RWBL Y1739 LZH、RWBL Y1615 ZC發酵結束后,銨鹽類降低高級醇效果明顯,而氨基酸類的添加后,高級醇則表現出不同的形式。但是對于RWBL Y1739 LZH 銨鹽降低高級醇效果大小順序(氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二銨、碳酸氫銨、尿素)與RWBL Y1615 ZC銨鹽效果順序(氯化銨、磷酸氫二銨、碳酸氫銨、硫酸銨、尿素)存在差別,這說明酵母種類也是產生高級醇的關鍵因素。RWBL Y1739 LZH發酵結束后除L-苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸外,相對于對照組可同化氮素的添加降低高級醇效果明顯,銨鹽的添加有助于降低高級醇含量。這與徐姍娜等[8]研究銨鹽高級醇含量低于有機氮素;Torrea D等[23]通過向葡萄發酵酒液添加銨態氮降低了高級醇的含量;Vidal E E等[24]將銨態氮添加于可同化氮素含量低的甘蔗汁中后發現高級醇的含量降低;結果一致。其中氯化銨添加后高級醇降低了62.60%,但是L-苯丙氨酸添加后高級醇增加了0.25倍,纈氨酸添加后高級醇增加了0.46倍,亮氨酸添加高級醇增加了0.20倍。這可能是特定氨基酸的添加,促使Ehrlich轉化途徑增強。RWBL Y1615 ZC發酵結束后除L-苯丙氨酸、亮氨酸外,均有降低高級醇的效果,但是銨鹽類優勢更加明顯,這與RWBL Y1739 LZH具有相同結論。其中氯化銨的添加后高級醇降低了63.15%,而添加L-苯丙氨酸后高級醇增加了1.05倍,說明L-苯丙氨酸的添加,能顯著增加高級醇的含量。這與林樸[25]研究隨氨基氮的增多,高級醇的生成量表現為先降低后升高的變化趨勢的結果不一致,分析結果可能是高級醇的含量,與培養基的氮源濃度相關。

3 結論與展望

降低高級醇手段通常是改變酵母的高級醇代謝基因,而可同化氮素添加策略報道相對較少。可同化氮素的添加,具有簡單、快捷、穩定等特點。對發酵液中酵母的生長趨勢無顯著影響,磷酸氫二銨、碳酸氫銨、尿素能提高RWBL Y1739 LZH的酵母數量。尿素的添加能提高RWBL Y1615 ZC的酵母數量,硫酸銨、氯化銨并沒有起到促進作用。在黃酒發酵液中,可同化氮素的添加能提高RWBL Y1739 LZH乙醇產量,但是對RWBL Y1615 ZC的乙醇產量作用不明顯。黃酒發酵中銨鹽的添加是降低高級醇的有效途徑,對于RWBL Y1739 LZH、RWBL Y1615 ZC,氯化銨降低高級醇分別為62.60%,63.15%。這是釀制清爽型黃酒的新思路。在Ehrlich高級醇代謝途徑中,特定氨基酸的添加能提高高級醇的含量,這為黃酒發酵中提高某些特定的高級醇,提供好的方法。此外,研究發現RWBL Y1739 LZH產異戊醇更強,而RWBL Y1615 ZC產β-苯乙醇能力更強,無論是對照組,還是實驗組,都表現出相同的結論。

雖然已經有部分學者進行黃酒發酵過程中降低高級醇的研究。但多數研究是針對黃酒釀酒酵母的研究,通過基因改造來降低黃酒中的高級醇,但是降低高級醇的效果并不是很理想。而可同化氮素的添加是降低黃酒高級醇的一個有效途徑,目前并沒有在黃酒產業上進行大規模的應用,黃酒發酵的基礎技術研究仍然顯得薄弱,整體的生產技術與水平與啤酒、葡萄酒仍然存在差距。黃酒作為酒中國粹,值得發揚和傳承。對黃酒高級醇的研究應從經驗走向理論,從實驗平臺走向生產平臺,應用現代高新技術,建立完善的黃酒發酵體系,這是實現黃酒技術升級和持續發展的關鍵,也是黃酒走向人文化,科技化、健康化的關鍵。

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