產葉酸乳酸菌的篩選及對發酵乳的影響

曹 佩,陳杉杉,王文文,潘道東,2,吳 振,*,曾小群

(1.寧波大學浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室,浙江寧波 315211; 2.南京師范大學食品科學與營養系,江蘇南京 210097)

乳酸菌作為人體腸道一類重要的益生菌,具有調整腸道菌群平衡,促進營養成分吸收,提高免疫力,預防和抑制腫瘤發生,緩解乳糖不耐癥,降解膽固醇等作用[19-20]。且其分解代謝可以產生供機體生長的多種維生素,如葉酸。Crittenden等[21]利用微生物法測定32株乳酸菌在發酵乳發酵過程中產生葉酸的能力,發現嗜熱鏈球菌具有高產葉酸的能力,且采用雙歧桿菌與嗜熱鏈球菌復配發酵脫脂乳時,其產生的葉酸濃度可提高6倍。荷蘭的Wegkamp等[22-23]利用基因工程手段定向改造乳酸乳球菌,提高其產葉酸能力。Wilbert等[24]利用HPLC法來篩選能產葉酸的乳酸菌,結果發現相比球菌的產葉酸能力,乳酸桿菌中的植物乳桿菌具有產葉酸的能力。由此可見,乳酸菌是生物合成葉酸最好的選擇。但現有的研究致力于檢測乳酸菌產葉酸的能力,而對將產葉酸的乳酸菌發酵酸奶并研究其對發酵乳的影響這方面研究較少。

本文通過高效液相色譜法從本實驗室已有的5株乳酸菌中篩選出高產葉酸的乳酸桿菌,并且將高產葉酸菌株以不同比例與基礎菌復合發酵,從發酵乳的質構,理化性質及感官特性等方面探索高產葉酸菌株對發酵乳品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌 寧波大學農畜產品加工實驗室提供;MRS培養基 青島高科園海博生物技術有限公司;氨水、十二水合磷酸氫二鉀、二水合磷酸二氫鉀、氯化鈉(均為分析純)、甲醇(色譜純) 均購于國藥集團化學試劑有限公司;葉酸標準品(色譜級) 阿拉丁試劑上海有限公司;胰酶 美國Sigma公司。

安捷倫1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Infinite M200 PRO型光柵型多功能酶標儀 瑞士TECAN公司;YXQ-LS-100SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;FJL型發酵乳發酵柜 煙臺凱達電器有限公司;5804 R型離心機 艾本德中國有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 江蘇蘇州凈化設制有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠;FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SMSTA.XTPlus41720型質構儀 英國Stable Micro System公司;UL 40BC型乳成分分析儀 杭州浙大優創科技有限公司;水相針式過濾器 美國Millipore公司;移液槍 美國賽默飛公司。

1.2 培養基與主要試劑的配制

MRS培養基:準確稱量52.24 g MRS肉湯,加熱溶解于1000 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。

0.5%生理鹽水:量取5 mL的氨水于燒杯中,用少量去離子水溶解,轉移到1000 mL容量瓶中,并用去離子水定容至1000 mL,搖勻,備用。

0.5%的氨水:量取0.5 mL的氨水于燒杯中,用少量去離子水溶解,轉移到100 mL容量瓶中,并用去離子水定容至100 mL,搖勻,備用。

0.1 mol/L pH為7.2的PBS溶液:先準確稱取17.9 g的K2HPO4·12H2O,用去離子水定容至500 mL容量瓶;再稱取7.8 g二水合磷酸二氫鉀,用去離子水定容至500 mL容量瓶;將兩者混勻,將pH調至7.2。

1.3 乳酸菌產葉酸能力的測定

1.3.1 樣品處理 根據徐玲燕[14]等人方法作出部分修改,將植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌以1%的接種量接種活化后,再以3%的量接入100 mL的MRS培養基進行擴大培養,于37 ℃下培養至穩定期。將培養好的發酵液以8000 r/min離心5 min后,分別取4 mL發酵液并同時加入1 mL胰酶于10 mL離心管中,做樣本對照,靜置2 h,使胰酶充分將發酵液中的蛋白類物質進行酶解完全。酶解后,以8000 r/min離心5 min,去沉淀,分別加入0.1 mL 0.5%提前配制好的氨水,溶解后用0.22 μm的濾膜過濾,避光待用。

1.3.2 標曲的配制 準確稱量20 mg葉酸標準品,加入10 mL 0.5%的氨水助溶并用去離子水定容至50 mL,制得濃度為0.4 mg·mL-1的葉酸標準儲備液。再從中取出1 mL,將其稀釋至100 mL,制得濃度為0.004 mg/mL,即4 μg/mL的葉酸標準中間液。最后從中間液中分別準確吸取1、2、4、6、8、9 mL,用去離子水定容至10 mL,制得濃度分別為0.4、0.8、1.6、2.4、3.2和3.6 μg/mL的葉酸標準工作液。用0.22 μm的濾膜過濾,避光待用。

1.3.3 色譜條件 通過全波長掃描及梯度洗脫得出最佳色譜條件為:流動相∶甲醇∶PBS(0.1 mol,pH=7.2)=7∶1∶2;色譜柱:EclipseXDB-C18,5 μm,4.6×150 mm。柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm流量:1 mL/min。

1.3.4 標曲繪制及不同菌產葉酸量的測定 利用高效液相色譜法測定葉酸標準樣品繪制標準曲線后對處理好的樣品進行葉酸含量測定。乳酸菌產葉酸量按以下公式計算:

產葉酸量(μg/mL)=x-x0

式中：x表示發酵液中總葉酸含量,x0表示空白組中葉酸含量,μg/mL。x與x0根據標準曲線計算公式(見2.1.1)得出。

1.4 產葉酸乳酸菌對發酵乳的影響探究

1.4.1 發酵乳的制備 純牛奶→接入6%的不同菌種比例(見表1)的乳酸菌,43 ℃下發酵7 h(母發酵劑)→按20%的接種量接入母發酵劑,加糖量為3%,于43 ℃下發酵7 h(中間發酵劑)→按20%的接種量接入中間發酵劑,于43 ℃下發酵7 h(工作發酵劑)→按20%的接種量接入工作發酵劑,于43 ℃下發酵7 h→于4 ℃后熟24 h→酸奶[25-26]。

表1 母發酵劑中菌種比例Table 1 Ratio of bacteria in starter cultures

1.4.2 發酵乳樣品pH的測定 實驗樣品從冰箱取出后使其表面溫度升至20 ℃,采用精密pH計測量其酸度變化[27]。

1.4.3 發酵乳樣品持水力的測定 在離心管中各加入質量為10 g的酸奶樣品,4 ℃,3000 r/min離心10 min,靜置,棄去上清液,稱其剩余質量為W,則其持水力的計算公式為:持水力(%)=W/10×100[28-29]

1.4.4 發酵乳的質構測定 采用英國SMSTA.XTPlus41720質構儀對酸奶樣品的硬度,粘性,內聚性,膠粘性等質構特性進行測定。測定條件:采用直徑為3.5 cm的圓盤形探頭,探頭型號為A/BE,測試速率為1 mm/s,探頭下降距離為30 mm。其中硬度是指第一次穿沖樣品中的壓力峰值。粘性是模擬表示在探頭與樣品接觸時用以克服兩者表面間吸引力所必需的工作,是第一次穿刺的負面積。內聚性是模擬樣品內部粘合力,是樣品經第一次壓縮變形后所表現出來的對第二次壓縮的相對抵抗能力。膠粘性是用來模擬表示將半固體樣品破裂成吞咽時的穩定狀態所需的能量[30]。

1.4.5 發酵乳感官評定 邀請10名具有一定經驗的人員組成感官評定小組,根據感官評定標準從外觀組織形態、口感、滋氣香味三方面對產品進行打分,采用九分制評分方法[31],評分細則如表2所示。

表2 酸奶感官評定評分標準(分)Table 2 Criteria for sensory evaluation of yogurt(score)

1.5 數據處理與統計分析

上述每組樣品做三個重復,采用SAS 8.0統計軟件進行統計學分析,多組間比較采用單因素方差分析,差異顯著水平為p<0.05,極顯著水平為p<0.01。采用Origin 8.0軟件和Excel軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 產葉酸乳酸菌的篩選結果

2.1.1 標準曲線的繪制 利用高效液相色譜法,根據上述色譜條件,以葉酸標樣濃度為橫坐標x,峰面積為縱坐標y,得其回歸方程為:y=37.642x+7.5527,R2=0.9962。

2.1.2 不同菌株產葉酸結果分析 利用高效液相色譜法測定5株乳酸菌發酵液中葉酸含量,結果如表3所示:植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌具有較好的葉酸生成能力,這與Wilbert、Rossi以及Hugenschmidt 等研究結果一致。Wilbert[24]等研究表明乳球乳酸菌能夠合成葉酸,而乳桿菌屬中也有少量能夠合成葉酸,如植物乳桿菌。Rossi等[32]也認為野生乳桿菌屬有少數可以產葉酸的菌株。而Hugenschmidt 等[33]的研究證明Lb.plantarum SM39是高產葉酸的菌株。本研究中,植物乳桿菌以及嗜酸乳桿菌均屬于高產葉酸的乳桿菌,植物乳桿菌發酵液中的葉酸含量為51.40 μg/mL,嗜酸乳桿菌發酵液中的葉酸含量為34.77 μg/mL。說明植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌中含有合成葉酸必要的基因,而其他乳酸菌中不含或者缺失部分合成葉酸的基因,從而導致乳酸菌無法合成葉酸。

表3 不同菌株產葉酸量Table 3 The production of folic acid from different strains

2.2 產葉酸乳酸菌對發酵乳pH的影響結果

不同組發酵乳的pH檢測結果如圖1所示。

圖1 產葉酸乳酸菌對酵乳pH的影響Fig.1 Effect of folic acid lactic acid bacteria on the pH of fermented milk注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

由圖1可看出:組別1為對照組,其pH最高,而組別2至組別7為添加不同比例產葉酸的菌種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵的酸奶,測得酸奶的pH均比對照組要低。通過SAS 8.0軟件分析得出p>0.05,說明添加一種高產葉酸的乳桿菌后,與對照組比較,發酵乳pH會下降,但差異不顯著,但是添加兩種產葉酸的乳桿菌的發酵乳與對照組比,pH下降明顯,差異顯著。說明高產葉酸乳桿菌有較好的產酸性能,當兩種產葉酸乳桿菌混合發酵時,產酸效果更好,可能由于產葉酸乳桿菌發酵時產生的葉酸能夠促進乳酸菌活力,從而使pH下降。pH的降低還可能由于制作發酵劑時添加的菌種比例不同,菌的活性強弱不同引起。

2.3 產葉酸乳酸菌對發酵乳持水力的影響

不同組發酵乳的持水力檢測結果如圖2所示。

圖2 不同發酵劑對發酵乳持水力的影響Fig.2 Effect of different starter cultures on the water-holding capacity of fermented milk注：不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

持水力表示的是發酵乳在經過離心處理后所能保留的水分,多數是能與凝膠分子結合較牢的水分,可以較大程度的影響發酵乳的風味和組織形態,受總固形物和總蛋白含量的影響。衛曉英等[34]研究表明,酸乳持水力對酸乳質構包括黏度、硬度、黏聚度等產生影響,從而改變酸乳品質。由圖2可知,發酵乳的持水力在添加了產葉酸的菌株后,其值有所下降。通過SAS 8.0分析得出p<0.01,即添加產葉酸菌種對發酵乳的持水力有極顯著影響,可能由于產葉酸乳酸菌引起發酵乳中產生了更多由蛋白質網絡結構的毛細血管束縛著的自由水,使發酵乳在發酵期間有乳清析出的現象,發酵乳的組織狀態不好,粘黏性較差[35]。

2.4 產葉酸乳酸菌對發酵乳質構特性的影響

利用質構儀從硬度,膠黏性,內聚性和黏性角度對發酵乳的質構特性進行檢測,結果如表4所示。

表4 不同發酵劑對發酵乳質構的影響Table 4 Effects of different starter cultures on texture of fermented milk

發酵乳的質構特性是發酵乳感官評價一些指標的數據體現,是對發酵乳的客觀評價,其不僅體現在口感方面,更能說明發酵乳質量的穩定性[36]。而不同發酵乳質構的變化,是因為發酵劑中菌株影響了發酵劑的凝膠過程中與酪蛋白分子相互作用,進而影響到酪蛋白的相互聚集作用,從而引起了質構特性的變化[27]。由表4可以看出:實驗組發酵乳質構與對照組相比發生變化。通過SAS 8.0分析得出:各實驗組與對照組的發酵乳在硬度、膠黏性、內聚性、黏性上有極顯著差異,p<0.01,且實驗組優于對照組。實驗組6的硬度、膠黏性、內聚性、黏性均高于其他組。實驗組4的硬度、黏性均低于其他實驗組。說明添加了產葉酸乳桿菌對發酵乳質構有較好影響,而添加兩種產葉酸乳桿菌對發酵乳質構的影響優于添加一種產葉酸乳桿菌。可能是因為添加產葉酸乳桿菌導致發酵乳pH下降,使酪蛋白粒子相互聚集形成較為緊密的結構,從而使發酵乳的硬度,膠黏性明顯提高。

2.5 產葉酸發酵乳對發酵乳感官的影響

品評員分別從外觀、口感、滋氣味三方面對七種不同菌種復配發酵劑發酵的酸奶進行感官評價,結果如圖3所示。

圖3 不同發酵劑的感官評價圖Fig.3 Sensory evaluation of different starter cultures

由圖3可知,實驗組發酵乳在感官評價上與對照組也有差異。從結果可以看出實驗組的表面稠度,酸度,光滑度較對照組更好,而發酵乳的感官和質構,持水力及pH有一定的聯系,可能由于添加產葉酸乳桿菌對發酵乳的硬度,膠黏性,內聚性及黏性有所改善,從而使發酵乳的表面稠度和光滑度提高。而添加產葉酸的乳桿菌會降低發酵乳的pH,從而使發酵乳的酸度優于對照組。

3 結論

開發葉酸強化食品是解決葉酸缺乏癥的重要發展方向。采用高效液相色譜法快速檢測5株乳酸菌發酵液中葉酸含量,證實了植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌有很好的產葉酸能力。其中,植物乳桿菌的葉酸濃度為51.40 μg/mL,嗜酸乳桿菌的葉酸濃度為34.77 μg/mL。進一步利用該2株乳酸菌與基礎發酵劑混合發酵酸乳,通過檢測發酵乳的理化指標以及數據分析,發現產葉酸乳酸菌對發酵乳的質構,酸度等都有很好的改善作用,當兩種產葉酸乳桿菌共同發酵時,效果更好。但是添加產葉酸乳桿菌會使發酵乳的持水力有所下降,后續研究可以通過調整發酵溫度等條件來改善發酵乳的持水力。該研究為開發富含葉酸發酵乳提供了一定的理論依據。

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