牦牛血胰蛋白酶水解液中抗菌肽的篩選研究

郝 剛,唐善虎,李思寧

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

尋求新型抗菌劑是解決目前日趨嚴重的細菌耐藥性的一種途徑。抗菌肽又稱抗微生物肽(antimicrobial peptides)或肽抗生素(peptide antibiotics),是生物體內源性具有強抗菌作用的多肽,是生物先天免疫的重要組成部分[1-2]。自上世紀七十年代瑞典科學家Boman等[3]在天蠶血淋巴中首次發現抗菌肽以來,抗菌肽一直是生命科學研究的熱點之一。國內外研究者相繼在兩棲動物、昆蟲、魚類、哺乳動物等各種生物中發現了大量的抗菌肽[4-6]。

現已從動物血紅蛋白中分離出了具有抗菌活性的肽類,并對其生理功能進行了分析。張艷梅等從豬血中提取的抗菌肽不僅對供試細菌的形態結構有明顯的損傷作用,同時還影響細菌的生長繁殖[7]。張慶華等從牛血中分離的血紅蛋白抗菌肽對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC分別為0.5、1.0、0.25 mg/mL[8]。抗菌肽P3是從牛血紅蛋白α亞基分離出來的一種廣譜抗菌肽,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有一定的抑制活性[9]。

牦牛主要分布在我國青藏高原3000 m以上的高寒地帶,牦牛血液紅細胞中含有高達9%以上的血紅蛋白[10-11]。目前,對牦牛血的研究報道主要集中在提取超氧化物歧化酶、血紅素、免疫球蛋白等[12],關于牦牛血紅蛋白抗菌肽分離純化的研究未見報道。研究指出,利用抗菌肽與細菌細胞之間的吸附結合性質,將經過細菌細胞吸附后的樣品與吸附前樣品組分進行對比,能夠快速準確的定位抗菌肽組分,提高分離效率[13]。本研究以牦牛血的胰蛋白酶水解液為原料,經胰蛋白酶酶解,利用抗菌肽與大腸桿菌細胞的吸附結合特性,用Sephadex G-15凝膠色譜和C18反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化新型抗菌肽,并檢測新抗菌肽的抑菌活性,為抗菌肽這類含量較少的生物活性物質的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichcoli)ATCC 25922、綠膿桿菌(Bacteriumpyocyaneum)ATCC 27553、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)50013、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)51302、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)6538、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)9372、單胞李斯特菌(Listeriamonocytogene)54002、溶血鏈球菌(Streptococcushemolyticus)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、粘質沙雷菌(Serratiamarcescens)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、新型串酵母(Cryptococcusneoformans)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 以上菌株由西南民族大學食品科學實驗室保存;牦牛血 成都天屹生物科技有限公司;檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 成都科龍化工試劑廠;苯甲基磺酰氟(PMSF) Amresco公司;胰蛋白酶(酶活10萬U/g) 河南唐古食品配料有限公司;三氟乙酸(TFA) 色譜純,Fluka公司;乙腈 色譜純,Merck公司;Sephadex G-15 Sigma公司;LB培養基(溶菌肉湯培養基) 青島青藥生物工程有限公司;PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基) 南通凱恒生物科技發展有限公司。

半制備型高效液相色譜儀(YWG C18250 mm×10 mm) 美國Waters公司;Centrifuge 5804型離心機 德國Eppendorf公司;FE20型pH計 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;ELX808酶標儀 美國BIO-TEK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛血酶解液的制備 收集新鮮的牦牛血,過100目篩網,加入10%檸檬酸鈉迅速抗凝[14],2000×g離心10 min取紅血球,按1∶1加水(重量比),快速攪拌破膜,調節pH至8.0,按紅血球量加入0.03‰胰蛋白酶,50 ℃下酶解10 h。酶解結束后,調節pH至5.0以下,同時加熱至90 ℃以上維持30 min滅酶,然后2000×g離心10 min取上清液,即得到牦牛血酶解液。

1.2.2 抗菌肽細菌吸附結合實驗 參考Tang的方法[13]。將培養至對數生長期的大腸桿菌2000×g離心10 min,收集菌體,用無菌PBS(10 mmol/L,pH7.0)緩沖液洗滌,然后與牦牛血酶解液混合,于37 ℃孵育10 min,經0.22 μm濾膜過濾,濾液即為細菌吸附結合后的牦牛血酶解液,將其冷凍干燥,-70 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.2.3 凝膠過濾層析確定目標抗菌肽 實驗采用Sephadex G-15凝膠柱(50 cm×2 cm),用緩沖液進行平衡。取3 mL牦牛血酶解液上樣,緩沖液洗脫20 h,在220 nm監測洗脫情況;同樣取3 mL細菌結合后的牦牛血酶解液(1.2.2制備)上樣,洗脫條件同上。對比兩凝膠色譜圖,細菌結合后的牦牛血酶解液凝膠色譜圖減少的洗脫峰即為含有目標抗菌肽的組分。在其他條件相同的情況下,探討了洗脫液類型(pH7.0磷酸鹽緩沖溶液、pH5.0醋酸緩沖溶液、Tris-鹽酸緩沖溶液)與洗脫流速(0.1、0.4、1.0 mL/min)對Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響。

1.2.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化 參考Hocquellet 的方法[15],對確定含有目標抗菌肽的凝膠色譜洗脫峰進行收集,采用YWG C18反相柱(250 mm×10 mm×10 μm)進行RP-HPLC分離純化。流動相A:0.1% TFA溶液,B:80% 乙腈(含0.1% TFA);色譜條件:色譜柱用0.1% TFA平衡后,采用線性梯度法進行洗脫并收集,梯度為B:0～100%洗脫80 min,上樣量2 μL,流速1 mL/min。在214 nm處測其光密度,收集各單峰進行純化。抗菌活性組分凍干后,用0.1%TFA溶解后再次經過Kromasil C18反相柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)進行二次HPLC分離,流速0.5 mL/min,其它色譜條件同上。

1.2.5 抗菌肽抑菌活性的測定 最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)參考文獻[16]方法測定。將培養至對數生長期的待測菌液(細菌接種在LB培養基、真菌接種在PDA培養基,當菌數達到104～105CFU/mL時得到待測菌液)加入96孔細胞培養板,每孔50 μL,再向各孔中加入50 μL經倍比稀釋的抗菌肽,使各孔中抗菌肽濃度分別為0.5、1、2、4、8、16 μg/mL。以加入0.4%多聚甲醛50 μL的孔為陽性對照,加入滅菌的去離子水50 μL的孔為陰性對照。細菌在37 ℃培養6 h,真菌在28 ℃培養12 h后,用酶標儀在λ=630 nm檢測OD值。與初始值相比,OD值未有顯著變化的最小抗菌肽濃度定義為抗菌肽對該菌的最低抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 Sephadex G-15凝膠過濾分離抗菌肽

2.1.1 洗脫液類型對Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響 其它層析條件不變的情況下,3種不同的緩沖溶液分離效果如圖1所示(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。對比三種洗脫緩沖液,在其它分離條件不變的情況下,10 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液分離效果相對較好(見圖Ⅲ),牦牛血酶解液可大致分為7個組分。因此本實驗采用磷酸鹽緩沖液為最佳洗脫液。

圖1 不同類型洗脫液對Sephadex G-15 分離抗菌肽效果的影響Fig.1 Effect of different elution buffers on the separation of antimicrobial peptide

2.1.2 洗脫劑流速對Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響 洗脫液的流速也是影響分離效果的重要因素。不同流速洗脫液分離抗菌肽效果見圖2(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。從圖2可以看出,當流速為1 mL/min時,由于流速過快,導致出峰的時間相對提前,峰形扁平,有一些小峰沒有分開。流速0.4 mL/min時分離效果好,分離時間較短。流速0.1 mL/min時,低流速會引起分離時間的延長,工作效率降低,因此本實驗選擇0.4 mL/min為最佳流速。

圖2 不同洗脫流速對Sephadex G-15 分離抗菌肽效果的影響Fig.2 Effect of different flow rates on the separation of the antibacterial peptide

綜合以上分析結果,用Sephadex G-15分離牦牛血酶解液抗菌肽時,樣品濃度50 mg/mL,上樣量3.0 mL,流速0.4 mL/min,磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.0)為洗脫劑,可取得較好的分離效果。在此條件下,分離得到了7個組分,見圖3。

圖3 Sephadex G-15分離抗菌肽凝膠色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography profile of the antibacterial peptides on Sephadex G-15 column

2.2 細菌胞膜吸附分離牦牛血酶解液抗菌肽

2.2.1 細菌細胞結合實驗 牦牛血酶解液與大腸桿菌孵育后,其中膜作用抗菌肽會與細菌細胞結合,并隨菌體一同被過濾去除[13]。與細菌結合后的牦牛血酶解液的凝膠色譜圖見圖4。與圖3(未與細菌孵育的牦牛血酶解液凝膠過濾圖)相比,圖4中洗脫峰2和峰5減少,其余洗脫峰與圖3中相應洗脫峰的峰形和洗脫時間相類似。由此推斷,峰2與峰5應該為含有目標抗菌肽的組分。分別對峰2和峰5組分進行活性測定,發現峰5抗菌活性高于峰2。因此選擇峰5組分進行進一步的分離純化。

圖4 與大腸桿菌結合后牦牛血酶解液的G-15凝膠色譜圖Fig.4 Elution profile of yak blood zymolyte incubated with E. coli on Sephadex G-15 column

2.2.2 緩沖液pH對于細菌吸附結合實驗的影響 為了驗證細菌結合實驗的準確性和重現性,將大腸桿菌在pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中與牦牛血酶解液孵育,孵育后的濾液用Sephadex G-15柱進行分析,結果見圖5(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。

圖5 不同pH下與大腸桿菌結合后的牦牛血酶解物的凝膠色譜圖Fig.5 Elution profile of yak blood zymolyte incubated with E. coli on Sephadex G-15 column under different pH

從圖5中可看出,濾液分離后都得到5個組分。與圖3對比發現,圖5中的峰2和峰5均顯著下降或消失,因此認為利用細胞膜結合分離抗菌肽組分的重復性較好。在用Sephadex G-15凝膠柱分離抗菌肽時,發現洗脫液的類型對洗脫效果影響最大,醋酸緩沖液(pH5.0)和Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)都無法把組分分離完全,這可能是相對于磷酸鹽緩沖液(pH7.0),pH的改變使得酶解液中某些肽的氨基酸側鏈基團的電離發生變化,肽與肽之間的相互作用發生了改變,從而使得某些組分難以分開。中性磷酸鹽對于反相液相色譜分離效果是一種好的方法,且在此條件下蛋白可保持生物活性[17]。

2.3 RP-HPLC分離純化抗菌肽

采用半制備型RP-HPLC(YWG C18250 mm×10 mm)進一步純化圖3中的峰5,結果見圖6。對圖6中的各個組分進行收集,檢測其抗菌活性,活性最強的目標峰組分進一步采用RP-HPLC(Kromasil C18250 mm×4.6 mm)純化,結果如圖7所示。目標抗菌組分大約在53%乙腈(體積比)流動相洗脫下來的,這表明抗菌組分具有較強的表面疏水性。抗菌物質與細菌細胞膜的疏水作用對于其殺菌作用非常重要。Conlon等[18]研究表明抗菌肽可通過抗菌肽疏水的表面與細胞膜脂部分以及抗菌肽親水基團與細胞膜磷脂頭部親水部分結合。膜肽相互作用是由靜電相互作用和疏水相互作用決定的,而且這兩種相互作用存在敏感的平衡關系[19]。因此綜合實驗分析,推測抗菌肽YakB-1/2在pH7.0時的帶電荷量較少,與細菌細胞膜的吸附結合主要依靠疏水相互作用。

圖6 峰5組分的RP-HPLC圖譜(YWG C18 250×10 mm)Fig.6 RP-HPLC profile of peak 5(YWG C18 250×10 mm)

圖7 抗菌組分目標峰進一步RP-HPLC純化圖譜(Kromasil C18 250 mm×4.6 mm)Fig.7 RP-HPLC profile of further purification of antimicrobial fraction(Kromasil C18 250 mm×4.6 mm)

對于RP-HPLC組分1和2再次進行高效液相分析,結果顯示其為單一峰,已經達到色譜純(圖8),出峰時間分別為51.23 min及59.50 min。將組分1和2的抗菌肽分別命名為YakB-1和YakB-2。

圖8 抗菌肽RP-HPLC 組分1和2的二次RP-HPLC圖譜Fig.8 Subfraction of fraction 1 and 2 from the RP-HPLC

2.4 抗菌肽YakB-1/2的抑菌活性檢測

抗菌肽Buforin的MIC作為對照,抗菌肽YakB-1/2的抑菌活性結果見表1。

表1 YakB-1,YakB-2及抗菌肽Buforin的抗菌活性Table 1 Antimicrobial activitiy of YakB-1,YakB-2 and Buforin

總體上來看,抗菌肽YakB-2無論對G-菌還是G+菌的抗菌活性要比YakB-1強。無論是YakB-1還是YakB-2,對G+菌的抑菌活性比G-菌強,YakB-2尤其明顯。這可能是因為G-菌和G+菌外膜的組成成分不同[20]。除了新型串酵母,YakB-1對真菌的抑菌活性比YakB-2強,而抗菌肽YakB-1/2對細菌和真菌的抑菌活性都弱于Buforin。抗菌肽YakB-1/2的抑菌機理、氨基酸序列、與胞膜作用時的結構變化及膜作用機制還需要在后續的研究中進一步摸索和探究。

3 結論

牦牛血酶解液濃度50 mg/mL,上樣量3.0 mL,流速0.4 mL/min,10 mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液為洗脫劑,用Sephadex G-15分離牦牛血酶解液抗菌肽可取得較好的分離效果,獲得分離度較好的7個組分。通過RP-HPLC純化牦牛血酶解液中抗菌肽組分,分離得到兩個色譜純的抗菌肽YakB-1和YakB-2。菌肽YakB-1/2對細菌和真菌都具有廣譜抗菌活性,但抗菌肽YaKB-2對細菌的抗菌活性比YakB-1強,YakB-1對真菌的抑菌活性更強。

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