戊糖片球菌NCU301對豆粕強化發(fā)酵工藝優(yōu)化及營養(yǎng)成分的測定

王 浩,熊 濤,彭 珍,關(guān)倩倩,肖陽生

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

抗生素被批準(zhǔn)作為飼料添加劑以來,以其能有效地促進畜禽生長和提高飼料的利用率等優(yōu)點在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用,但同時也帶來了藥物殘留和抗藥性等一系列嚴(yán)峻的社會問題[1-2],尋找抗生素替代品已成為當(dāng)務(wù)之急,開發(fā)綠色、高效、安全的飼料添加劑是發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)的基礎(chǔ)[3]。目前抗生素替代品主要有益生菌、益生元、酸化劑、酶制劑、中草藥飼料添加劑等[4]。其中益生菌具有抑制動物腸道病原菌的生長、提高動物的免疫力及生產(chǎn)性能等優(yōu)點,現(xiàn)已成為飼料添加劑的研究熱點[5-6]。

豆粕作為大豆的副產(chǎn)品,蛋白含量高、氨基酸組成合理,是一種廉價優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白飼料[7]。但豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,這些抗?fàn)I養(yǎng)因子不僅會降低豆粕的利用率,還會影響動物對豆粕營養(yǎng)成分的消化、吸收、代謝,造成動物免疫力下降和生產(chǎn)性能降低等問題[7]。采用益生菌發(fā)酵豆粕不僅可以降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子還能夠提高豆粕中營養(yǎng)成分利用率[8-10]。陳中平[11]采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕,發(fā)酵后豆粕中小肽和氨基酸總量分別提高260.23%和634.62%;吳勝華等[12]利用酵母菌固態(tài)發(fā)酵豆粕,發(fā)酵后豆粕中的胰蛋白酶抑制因子降解率達56.2%;史艷麗等[13]采用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕,結(jié)果表明發(fā)酵后豆粕中抗原蛋白殘留率僅為5.9%。乳酸菌也是一類可作為飼料添加劑的益生菌,目前的報道多集中在采用乳酸桿菌作為發(fā)酵菌株,鄭裴采用植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕(滅菌),結(jié)果表明植物乳桿菌能夠顯著降低豆粕中的脲酶活性,然而關(guān)于采用乳酸片球菌強化發(fā)酵豆粕的研究還鮮有報道[14-16]。

本實驗以實驗室前期篩選保藏的益生菌株-戊糖片球菌NCU301作為強化發(fā)酵菌株,對未滅菌的豆粕進行接種強化發(fā)酵,以乳酸菌總活菌數(shù)作為指標(biāo),研究發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比、接種量等因素對乳酸菌總活菌數(shù)的影響,同時測定豆粕經(jīng)接種發(fā)酵和自然發(fā)酵后的營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化,旨在確定發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件,以期為生產(chǎn)實踐中豆粕的發(fā)酵提供理論支撐和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌NCU301(PediococcuspentosaceusNCU301) 由南昌大學(xué)食品科學(xué)與工程國家重點實驗室保藏;二級豆粕(含氮量43%) 市售;牛胰蛋白酶 美國Amresco公司;鹽酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜、CaCl2、尿素、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、K2SO4,NaCl,CuSO4、H2SO4、硼酸等 均為分析純;MRS液體培養(yǎng)基;MRS固體培養(yǎng)基按照文獻[17]中的方法配制。

Airtech生物安全柜 蘇凈集團安泰公司;DNP-9272型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;ME204E電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;S433D-全自動氨基酸分析儀 賽卡姆科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 自然發(fā)酵工藝 稱取未滅菌的豆粕50 g,加入50 mL去離子水,攪拌混勻,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱固態(tài)發(fā)酵50 h。

1.2.2 菌種活化及發(fā)酵 將保藏在甘油管的菌種以2%的接種量種接入MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,活化兩次。將活化好的菌種按10%的接種量接種到一定料水比的50 g豆粕基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在37℃下發(fā)酵48 h,發(fā)酵結(jié)束后測定乳酸菌總活菌量。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發(fā)酵時間 以50 g豆粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,料水比1∶1,接種量10%(8.60～8.69 lg(CFU/g)),培養(yǎng)溫度37 ℃,分別發(fā)酵24、36、48、60、72 h。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度 以50 g豆粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,料水比1∶1,接種量10%,分別在27、32、37、42、47 ℃下恒溫發(fā)酵48 h。

1.2.3.3 料水比 以50 g豆粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種量10%,培養(yǎng)溫度37 ℃,分別設(shè)定1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2的料水比發(fā)酵48 h。

1.2.3.4 接種量 以50 g豆粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,料水比1∶1,培養(yǎng)溫度37 ℃,分別以4%、6%、8%、10%、12%的接種量進行發(fā)酵48 h。

1.2.4 響應(yīng)面實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取對乳酸菌總活菌量影響較大因素,以乳酸菌總活菌量為響應(yīng)值,應(yīng)用design-expert8.0.6的Box-Behnken設(shè)計3因素3水平的實驗方案。以確定各因素對發(fā)酵豆粕中乳酸菌總活菌量影響的顯著性和發(fā)酵條件的最優(yōu)組合,實驗設(shè)計的因子編碼及各自變量水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平及編碼Table 1 Codes and levels of response surface

1.2.5 測定乳酸菌活菌量 乳酸菌活菌數(shù)測定:稱取1 g樣品溶于9 mL無菌生理鹽水中,振蕩混勻,梯度稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,計數(shù)。

1.2.6 營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子檢測 粗蛋白含量測定:采用國標(biāo)《GB/T6432-1994》[18];酸溶性蛋白含量測定:采用國標(biāo)《GB/T22492-2008》[19];游離氨基酸含量測定:參照李琪等方法[20];脲酶含量測定:參照陳雷方法[21];胰蛋白酶抑制因子含量測定:參照李文立等方法[22];小肽含量=酸溶性蛋白含量-游離氨基酸含量。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 23.0;作圖軟件應(yīng)用Origin 8.6;響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及分析應(yīng)用Design-Expert 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對乳酸菌總活菌量的影響 如圖1所示,在接種NCU301固態(tài)強化發(fā)酵豆粕中,隨著發(fā)酵時間的變化,乳酸菌總活菌數(shù)一直保持在9.54 lg(CFU/g)以上,在發(fā)酵48 h時達到最大值,為9.84 lg(CFU/g),發(fā)酵48 h和60 h的乳酸菌總活菌數(shù)無顯著性差異(p>0.05),但與其它時間段的活菌數(shù)存在顯著性差異(p<0.05)。由此選擇適宜的發(fā)酵時間48 h。

圖1 發(fā)酵時間對乳酸菌總活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total number of lactobacillus viable cells注:圖中不同字母表示差異性顯著(p<0.05), 相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)(圖2～圖4同)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對乳酸菌總活菌量的影響 微生物的生長對溫度較為敏感,所以發(fā)酵過程中溫度是影響微生物生長和產(chǎn)物合成的重要因素[23]。由圖2可知,豆粕發(fā)酵過程中乳酸菌總活菌數(shù)隨著溫度的升高呈現(xiàn)先緩慢增加后降低的趨勢,這是因為溫度升高反應(yīng)速率加快,微生物的生長代謝也隨之加快,但溫度過高會降低反應(yīng)速率,微生物的生長代謝活性也隨之降低,不利于發(fā)酵的進行[24]。確定適宜的溫度為32 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperture on total number of lactobacillus viable cells

2.1.3 料水比對乳酸菌總活菌量的影響 料水比是影響發(fā)酵過程的另一重要因素,水分含量過低,基質(zhì)過于干燥,不利于微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌且影響化學(xué)反應(yīng)速率。而含水量過高則會造成基質(zhì)結(jié)塊,空氣流通不暢,染菌機率增加等不良影響[25]。由圖3可知,隨著料水比的比例增大,豆粕發(fā)酵過程中乳酸菌總活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升,后緩慢降低的趨勢,在料水比1∶0.8的條件下,乳酸菌總活菌量最高,因此適宜的料水比為1∶0.8。

圖3 料水比對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of material to water ratio on total number of lactobacillus viable cells

2.1.4 接種量對乳酸菌總活菌量的影響 發(fā)酵過程中,接種量過小,會延長微生物生長的遲緩期;接種量過大,發(fā)酵基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)、水分等不能滿足微生物正常生長所需[26]。由圖4可知,豆粕發(fā)酵過程中接種量對乳酸菌總活菌量無顯著性差異(p>0.05),在8%時活菌量最高,因此選擇8%作為最適接種量。

圖4 接種量對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of inoculation on total number of lactobacillus viable cells

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上,以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比為自變量,以發(fā)酵結(jié)束后豆粕中乳酸菌總活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值,確定最佳工藝條件,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 BOX-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results for BOX-Behnken

使用Design-Expert 8.06軟件對數(shù)據(jù)進行分析,建立乳酸菌總活菌數(shù)(Y)與發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、料水比(C)關(guān)系的二次多元回歸模型:

Y=11.48-0.19A-1.49B+0.025C-1.75AB+0.025AC-1.23BC-1.29A2-2.69B2-2.86C2

回歸方差分析見表3,回歸模型(p<0.0001)差異極為顯著,表明該模型有效;失擬項是用來描述合適模型附近數(shù)據(jù)的變動,此失擬項的結(jié)果為0.6704,差異不顯著(p>0.05),表明擬合的模型效果較好;決定系數(shù)R2=0.9859,說明此方程的擬合度良好,能夠?qū)CU301固態(tài)發(fā)酵豆粕的理論值進行預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

根據(jù)回歸分析和回歸擬合方程繪制相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖及對應(yīng)的等高線圖,如圖5所示。結(jié)果表明,發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度及發(fā)酵溫度和料水比的交互作用對乳酸菌總活菌數(shù)的影響顯著。通過軟件分析得到最佳發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時間50.0 h、發(fā)酵溫度30.0 ℃、料水比1∶0.82,在接種量8%的條件下,預(yù)測乳酸菌活菌數(shù)達到11.7×109CFU/g。以此條件進行三次實驗驗證,所得的乳酸菌活菌數(shù)為11.5×109CFU/g,與預(yù)測值的吻合度達到98.29%。

圖5 兩兩因素相互作用對乳酸菌 活菌數(shù)的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Counter chart and response surface for total number of lactobacillus viable cells under two factors interact

2.3 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化

從表4可知,豆粕經(jīng)過自然發(fā)酵和接種強化發(fā)酵后的營養(yǎng)成分均發(fā)生了變化,其中粗蛋白分別提高了4.13%和4.78%(p<0.05),可能是因為在發(fā)酵期間,基質(zhì)中的養(yǎng)分被微生物消耗而導(dǎo)致粗蛋白所占的相對比例發(fā)生變化,同時微生物將基質(zhì)中的非蛋白氮吸收轉(zhuǎn)化為菌體蛋白[27];由于強化發(fā)酵后的豆粕中微生物的總活菌量高于自然發(fā)酵豆粕中的微生物總活菌量,所以,豆粕經(jīng)強化發(fā)酵后粗蛋白的含量高于自然發(fā)酵。豆粕經(jīng)過自然發(fā)酵和強化發(fā)酵后,酸溶性蛋白分別提高了42.67%和36.04%(p<0.05),小肽含量分別顯著性的提高57.49%和52.21%(p<0.05),可能是因為發(fā)酵期間,微生物分泌的一些酶類物質(zhì)將大分子蛋白降解為小分子的多肽和氨基酸[28];自然發(fā)酵期間豆粕中含有大量能夠分泌蛋白酶的霉菌等微生物,而在強化發(fā)酵期間,這類微生物的生長受到乳酸菌抑制[29],因此,自然發(fā)酵后豆粕中的酸溶性蛋白和小肽含量要高于強化發(fā)酵后豆粕中的酸溶性蛋白和小肽含量。游離氨基酸經(jīng)強化發(fā)酵提高19.10%,而經(jīng)自然發(fā)酵下降12.36%,這可能是因為自然發(fā)酵中某些微生物利用氨基酸作為氮源[30],以及發(fā)酵過程中的美拉德反應(yīng)和酯化反應(yīng)消耗了氨基酸[31],而在強化發(fā)酵中乳酸菌及其代謝物能夠抑制這類微生物的生長繁殖[32]。

表4 豆粕發(fā)酵前后營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化Table 4 Changes of nutrients and anti-nutritional factors of fermented soybean and unfermented soybean

豆粕中存在多種會造成畜禽生產(chǎn)性能下降和飼料利用率降低的抗?fàn)I養(yǎng)因子,而微生物發(fā)酵法可有效的降低這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量[33]。由表4知,胰蛋白酶抑制因子經(jīng)自然發(fā)酵和強化發(fā)酵后分別降低了61.62%和89.56%(p<0.05),脲酶含量也下降了79.31%和91.72%(p<0.05),表明豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量和脲酶含量呈正相關(guān)關(guān)系,這與尹慧君的研究結(jié)果一致[34]。

3 結(jié)論

本實驗以NCU301作為強化發(fā)酵菌株,優(yōu)化了豆粕固態(tài)強化發(fā)酵的生產(chǎn)工藝,最終確定最適的發(fā)酵條件為:發(fā)酵時間50.0 h、發(fā)酵溫度30.3 ℃、料水比1∶0.82、接種量8%,發(fā)酵結(jié)束后,豆粕中乳酸菌總活菌量提高至1.15×1010CFU/g。豆粕經(jīng)接種強化發(fā)酵后與未發(fā)酵相比,其中粗蛋白、酸溶性蛋白、小肽、游離氨基酸總量與分別提高4.78%、36.04%、52.21%、19.10%,胰蛋白酶抑制劑活性和脲酶活性分別下降89.56%、91.72%,而與自然發(fā)酵后豆粕中的粗蛋白、游離氨基酸總量相比分別提高0.6%、35.89%,酸溶性蛋白、小肽,胰蛋白酶抑制劑活性和脲酶活性分別下降4.64%、3.35%、72.79%、60%。該發(fā)酵產(chǎn)品可以提高動物對飼料的消化性,增加動物的生產(chǎn)性能,同時富含益生菌等有益成分可以改善動物的胃腸道菌群,提高動物的免疫力,與滅菌的發(fā)酵豆粕相比,可以降低生產(chǎn)成本,這為發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)提供了理論基礎(chǔ)。

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