N-糖基化對(duì)重組木聚糖酶XynA酶學(xué)特性的影響

張笑雨,高思宇,李秀婷,楊 然,*

(1.北京工商大學(xué),食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048; 2.北京工商大學(xué),北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048； 3.北京工商大學(xué),北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心,北京100048)

木聚糖(Xylan)存在于植物細(xì)胞壁中,是含量?jī)H次于纖維素的自然界第二豐富的可再生資源[1]。木聚糖酶(Xylanase)作為降解植物細(xì)胞壁半纖維素的關(guān)鍵水解酶之一,廣泛地存在于細(xì)菌、真菌、酵母菌和反芻動(dòng)物的瘤胃中[2],目前應(yīng)用于輕工[3]、飼料[4]、能源以及食品工業(yè)中[5]。

由于天然菌株表達(dá)木聚糖酶難以大規(guī)模的生產(chǎn),且優(yōu)良性能的酶較少而限制其應(yīng)用范圍[6],為此越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注重組木聚糖酶的異源表達(dá),如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)等。其中巴斯德畢赤酵母作為高效表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng),具有遺傳穩(wěn)定,表達(dá)高效及對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后加工等優(yōu)點(diǎn),已有數(shù)百種外源蛋白在該系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)表達(dá)[7]。同樣畢赤酵母表達(dá)體系具有許多真核表達(dá)系統(tǒng)所特有的特點(diǎn),如蛋白酶加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化修飾作用等[8],其中N-糖基化修飾是蛋白質(zhì)主要的翻譯后修飾之一[9],許多蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)多與糖基化修飾密切相關(guān),如對(duì)于許多蛋白質(zhì)的正確折疊分泌是必需的,同時(shí)能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的成熟構(gòu)象,增加其穩(wěn)定性等[10]。王茜[11]通過(guò)脫糖基化酶Endo H去除重組植酸酶 phy(QF)的糖鏈,發(fā)現(xiàn)糖基化的植酸酶與未糖基化的植酸酶相比最適溫度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃,對(duì)酶的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。Guo[12]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃處理10 min可維持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃處理10 min酶活劇烈下降。Chang等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)去除N-糖基化修飾會(huì)降低木聚糖酶酶活和耐熱穩(wěn)定性,同時(shí)也影響了其最適pH。但是,也有文獻(xiàn)報(bào)道糖基化修飾不會(huì)顯著影響酶的熱穩(wěn)定性反而會(huì)使其熱穩(wěn)定性降低。雖然已有許多研究者成功的實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá),但是對(duì)GH11家族木聚糖酶N-糖基化修飾的研究較少,因此,研究N-糖基化修飾對(duì)木聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)以及對(duì)酶學(xué)特性的影響,對(duì)進(jìn)一步改造重組木聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)室前期,從一株枝鏈霉菌L2001中克隆得到木聚糖酶基因xynA并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了克隆與表達(dá),對(duì)其發(fā)酵條件控制和酶學(xué)特性進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。筆者通過(guò)SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)木聚糖酶基因xynA含有信號(hào)肽,表明其分泌到胞外,有被糖基化修飾的可能,同時(shí)通過(guò)NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè),xynA序列中含有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),而N-糖基化作用可能對(duì)重組蛋白的分泌及特性產(chǎn)生影響。因此,本文采用衣霉素處理畢赤酵母細(xì)胞,通過(guò)對(duì)比處理前后木聚糖酶的表達(dá)量及酶學(xué)特性,初步探究N-糖基化對(duì)木聚糖酶的分泌表達(dá)及酶學(xué)特性的影響,為木聚糖酶的定向改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α天根生化科技有限公司;重組質(zhì)粒pET28a-xynA畢赤酵母(PichiapastorisGS115)、表達(dá)載體pPIC9K 由實(shí)驗(yàn)室保存;Endo H酶(500000 U/mL)、T4 DNA連接酶(400000 U/mL)、限制性內(nèi)切酶EcoR I(20000 U/mL)、Not I(20000 U/mL)、SacI(20000 U/mL) NEB公司;LA Taq聚合酶(5 U/mL) TaKaRa公司;衣霉素 上海阿拉丁公司;質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒 OMEGA公司;Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶公司;木聚糖及酶活測(cè)定相關(guān)試劑 Sigma公司;引物合成 由奧科鼎盛公司完成,基因測(cè)序于北京華大基因公司完成;LB培養(yǎng)基 氯化鈉1%,胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,固體培養(yǎng)基加2%瓊脂,121 ℃濕熱滅菌20 min;BMGY培養(yǎng)基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甘油；BMMY培養(yǎng)基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇；篩選培養(yǎng)基MD 1.34% YNB、4×10-5%生物素、2%葡萄糖、2%瓊脂；篩選培養(yǎng)基MM 1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇、2%瓊脂；YPD培養(yǎng)基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂(參考www.invitrogen.com網(wǎng)站的操作手冊(cè))。

T100-Thermal cycler PCR儀、Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng) 美國(guó) BIO-RAD公司;EPS301 瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠;Microfuge 20R臺(tái)式微量離心機(jī) 德國(guó) Beckman 公司;ImageQuant 300凝膠成像儀、Multitemp Ⅲ恒溫循環(huán)水浴器 美國(guó)GE 公司;HR60-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海 STIK 公司;DHZ-DA 大容量全溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-xynA的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pET28a-xynA為模板,設(shè)計(jì)含EcoR I、Not I的上下游引物(xynA-F01:5′-CGGAATTCACGGTC GTCACCACG-3′;xynA-R02:5′-ATAAGAATGC GGCCGCTCACGACGACACCGTG-3′),經(jīng)PCR擴(kuò)增出不含信號(hào)肽的基因序列xynA[14],PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃ 2 min預(yù)變性;94 ℃ 30 s變性;61 ℃ 30 s退火;72 ℃ 1 min延伸,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min延伸。分別對(duì)目的基因xynA和真核表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行雙酶切并回收,于24 ℃連接2.5 h、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)重組質(zhì)粒pPIC9K-xynA的DNA測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建成功[15]。

1.2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選 將測(cè)序成功的pPIC9K-xynA重組質(zhì)粒經(jīng)SacI 限制性內(nèi)切酶線性化后,電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于MD平板上30 ℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌落,菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,挑取轉(zhuǎn)化子接種含有不同濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL)G418的YPD平板,30 ℃培養(yǎng)3～5 d,篩選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子,經(jīng)搖瓶復(fù)篩后,最終獲得一株重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-xynA[16]。畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取畢赤酵母GS115單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃搖床過(guò)夜;以1%接種量轉(zhuǎn)接100 mL YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃搖床過(guò)夜至OD=1.3～1.5;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用100 mL冰預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用50 mL冰預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用4 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,菌體用0.2 mL 1 mol/L山梨醇重懸并轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌1.5 mL離心管中備用(感受態(tài)細(xì)胞需現(xiàn)用現(xiàn)制)。電擊轉(zhuǎn)化方法:在80 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入1～5 μg線性化的質(zhì)粒輕柔混勻轉(zhuǎn)移至0.2 cm冰預(yù)冷的電擊杯于冰上放置5 min,設(shè)置電擊參數(shù)為1.5 kV、25 μF、400 Ω,電擊并迅速加入1 mL 1 mol/L山梨醇,涂布MD平板(參考www.invitrogen.com網(wǎng)站的操作手冊(cè))。

1.2.3 重組木聚糖酶XynA的誘導(dǎo)表達(dá) 將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，于29 ℃,250 r/min條件下富集培養(yǎng)48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min離心收集菌體,于無(wú)菌條件下重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),每隔24 h取樣并添加終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá),培養(yǎng)8 d后,發(fā)酵液4 ℃,8000 r/min離心5 min,取上清即為粗酶液。

1.2.4 衣霉素抑制畢赤酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)重組木聚糖酶XynA 將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，于29 ℃,250 r/min條件下富集培養(yǎng)48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min離心收集菌體,于無(wú)菌條件下重懸于50 mL 含不同濃度衣霉素(2、5、10、15 μg/mL)BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d,發(fā)酵液4 ℃,8000 r/min離心5 min,取上清即為粗酶液,以同樣培養(yǎng)的未加衣霉素培養(yǎng)的菌株為對(duì)照[17]。

1.2.5 內(nèi)切糖苷酶Endo H處理重組木聚糖酶XynA 在20 μg重組木聚糖酶中加入1 μL 10×糖蛋白變性緩沖液,補(bǔ)入滅菌高純水至總體積為10 μL;于100 ℃反應(yīng)10 min;加入2 μL 10×GlycoBuffer 3緩沖液,1 μL Endo H酶,7 μL無(wú)菌水至反應(yīng)總體積為20 μL,在37 ℃下溫育1.5 h。將反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 SDS-PAGE與PAS糖染色分析 SDS-PAGE 按照Laemmli[18]的方法進(jìn)行,濃縮膠濃度5.0%,分離膠濃度為10.0%,上樣量20 μL,電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍(lán)染色15 min后脫色。PAS糖染色[19]:取出SDS-PAGE后的凝膠,將其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1 h以固定蛋白條帶;然后將固定后的凝膠取出用5%的冰醋酸清洗2次,每次10 min;然后把凝膠浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中,于4 ℃中黑暗條件下氧化1 h;用5%冰醋酸將凝膠漂洗幾次后,用50 mL的偏重亞硫酸鈉溶液(0.2 g偏重亞硫酸鈉溶于100 mL 5%冰醋酸),浸泡10 min;用Schiff試劑于4 ℃中避光染色1 h;染色完畢后將凝膠用大量5%冰醋酸進(jìn)行清洗,即可見(jiàn)紅色糖蛋白電泳條帶。

1.2.7 木聚糖酶活力測(cè)定 木聚糖酶活力測(cè)定參考Miller GL[20]的DNS法。以1 mg/mL的木糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與540 nm處的吸光值計(jì)算所得還原糖的量。木聚糖酶的活力單位(U)定義為:在上述條件下,每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖(木糖)所需要的酶量。

1.2.8 抑制糖基化前后木聚糖酶酶學(xué)特性分析

1.2.8.1 pH對(duì)重組木聚糖酶活力的影響 采用實(shí)驗(yàn)室緩沖體系:甘氨酸(Gly)-鹽酸 pH2.0～3.0;檸檬酸-檸檬酸三鈉(Citrate)pH3.0～6.0;磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH6.0～8.0;Tris-鹽酸 pH8.0～9.0;甘氨酸(Gly)-氫氧化鈉pH9.0～10.0緩沖液調(diào)整酶液,使酶液處于不同的緩沖條件,按照方法1.2.7中酶活測(cè)定方法測(cè)定酶活力;穩(wěn)定性的測(cè)定,使酶液處于不同緩沖液下,50 ℃下保溫30 min,立即冰水浴終止反應(yīng),然后按照方法1.2.7中酶活測(cè)定方法測(cè)定剩余酶活力,以未經(jīng)保溫處理的酶液的木聚糖酶活力為100%對(duì)照。

1.2.8.2 溫度對(duì)重組木聚糖酶活力的影響 將酶液用最適pH緩沖液適當(dāng)稀釋,然后分別在不同溫度條件下(40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃)下反應(yīng),測(cè)定木聚糖酶活力,以最大值為100%,確定最適反應(yīng)溫度;用最適pH緩沖液對(duì)酶液按照酶液比緩沖液1∶5進(jìn)行適當(dāng)稀釋,分別在40～85 ℃(相鄰溫度間隔5 ℃)的不同溫度條件下保溫處理30 min,保溫結(jié)束后立即冰浴冷卻,然后按照方法1.2.7中酶活測(cè)定方法測(cè)定木聚糖酶的剩余酶活力,以未經(jīng)保溫處理的酶液的酶活力作為100%對(duì)照[14]。

1.2.8.3 離子濃度及螯合劑對(duì)木聚糖酶活性的影響 根據(jù)方法1.2.7酶活力的測(cè)定方法,考察最終濃度為10 mmol/L的金屬離子、螯合劑(EDTA)對(duì)酶活力的影響。以不添加任何金屬離子、鰲合劑的酶液作對(duì)照,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。金屬離子包括 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Al3+、Fe3+。

1.2.8.4 胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)木聚糖酶活力的影響 用相應(yīng)的pH2.0的 0.1 mol/L Gly-HCl和pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl 分別稀釋胃蛋白酶和胰蛋白酶液,蛋白酶的終濃度為0.1 mg/mL,在最適溫度和最適pH下考察酶活力,以未處理的木聚糖酶作為對(duì)照,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行,考察蛋白酶對(duì)酶活力的影響[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和兩因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析(two-way repeated-measures ANOVA)方法,采用SPSS軟件。所有酶活和相對(duì)酶活數(shù)據(jù)從三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)或平行所得,采用Excel繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-xynA的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pET28a-xynA為模板,以xynA-F01、xynA-R02為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到線性的目的片段xynA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖1所示,目的基因片段大小為574 bp。目的基因純化后與pPIC9K表達(dá)載體雙酶切、連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,陽(yáng)性克隆子篩選后,提取質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證(圖2),最后經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-xynA(圖3)構(gòu)建成功。

圖1 目的片段xynAFig.1 Target gene xynA注:M為Marker;泳道1、2為PCR產(chǎn)物。

圖2 菌落PCRFig.2 Colony PCR注:M為Marker;泳道1～3為菌落PCR產(chǎn)物。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-xynA示意圖Fig.3 Sketch map of recombinant expression plasmid of pPIC9K-xynA

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達(dá)載體pPIC9K-xynA經(jīng)SacI 線性化后,電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于MD平板(圖4A),挑取轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于含不同濃度 G418的YPD平板,初篩確定G418濃度為6.0 mg/mL,經(jīng)搖瓶復(fù)篩,最終篩選到一株木聚糖酶表達(dá)量較高的工程菌株GS115/pPIC9K-xynA(如圖4B中標(biāo)記4;另外,2,3為表達(dá)量較低的工程菌)。

圖4 MD平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子(A)及G418篩選結(jié)果(B)Fig.4 The transformants on the MD medium and the screening results

2.3 重組木聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)及衣霉素處理酵母細(xì)胞

衣霉素是一種常見(jiàn)的糖基化抑制劑,能在細(xì)胞內(nèi)抑制畢赤酵母表達(dá)蛋白的糖基化修飾,且其并不影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[17],因此在培養(yǎng)基中加入衣霉素培養(yǎng)后,能夠使原來(lái)發(fā)生糖基化的蛋白去糖基化。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,菌體OD600也逐漸升高(圖5),第7 d時(shí)開(kāi)始下降,這是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分消耗影響了酵母生長(zhǎng),但是添加衣霉素組與未添加衣霉素組的酵母生長(zhǎng)情況大體一致,因此衣霉素的添加并未影響畢赤酵母工程菌的正常生長(zhǎng)。

圖5 添加不同濃度衣霉素對(duì)于酵母菌體生長(zhǎng)的影響Fig.5 Influence of yeast growth by adding different concentration of tunicamycin

衣霉素對(duì)重組木聚糖酶表達(dá)效果的影響如圖6所示,重組木聚糖酶酶活隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加呈逐步上升的趨勢(shì),但隨著衣霉素添加濃度增高酶活有所下降,即不同程度抑制N-糖基化修飾的酵母菌分泌的木聚糖酶酶活與未添加組相比均有所下降,其中添加量為10、15 μg/mL分泌的重組酶酶活下降幅度比較大,剩余酶活力分別為82.35%、53.60%,而2、5 μg/mL相比酶活下降幅度不大,僅為0.92%和6.85%,造成酶活降低的原因可能是因?yàn)樘腔揎椏梢允沟鞍踪|(zhì)的正確折疊分泌而維持其功能,如果糖基化受到抑制,則不能實(shí)現(xiàn)應(yīng)有的功能狀態(tài)[22-23]。

圖6 不同濃度衣霉素對(duì)于XynA活力的影響Fig.6 The activity of XynA after treated with different concentration of tunicamycin

采用SDS-PAGE分析誘導(dǎo)培養(yǎng)第8 d衣霉素添加對(duì)重組木聚糖酶表達(dá)的影響,結(jié)果如圖7所示。泳道1～5均在45、35 kDa左右有條帶,且條帶逐漸變窄,當(dāng)衣霉素添加量為5、10、15 μg/mL(即泳道3、4、5)時(shí)25～35 kDa的條帶逐漸變亮,主條帶變暗,經(jīng)去糖基酶Endo H處理后可見(jiàn)在25 kDa左右出現(xiàn)條帶,表明隨著衣霉素添加量的增加,重組木聚糖酶N-糖基化的程度逐漸降低,但并未完全去除,接近編碼該木聚糖酶基因推測(cè)的結(jié)果24.0 kDa。這可能是因?yàn)楫叧嘟湍阜置诘牡鞍状蠖鄶?shù)為N-連接糖基化高甘露糖型,蛋白轉(zhuǎn)錄后會(huì)一定程度上增加寡糖鏈長(zhǎng)度。而增加的長(zhǎng)度約為平均每個(gè)支鏈8～14個(gè)甘露糖殘基,即去N-糖基化修飾后分子量約降低1～3 kDa[24]。由于N-糖基化動(dòng)態(tài)的發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,蛋白質(zhì)逐漸折疊成熟,這個(gè)過(guò)程中受到N-糖基化抑制劑衣霉素的影響,不僅添加糖鏈的大小不同,而且還會(huì)影響到糖鏈添加到蛋白質(zhì)上的位置,已有報(bào)道稱(chēng)N-糖基化發(fā)生的程度不僅和糖鏈大小有關(guān)還與連接位置有密切關(guān)系,并且對(duì)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)及活性帶來(lái)影響[9,25]。

圖7 添加不同濃度衣霉素的XynA粗酶液的電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin

如圖8所示,經(jīng)過(guò)對(duì)粗酶液進(jìn)行PAS糖染色分析,糖原染色后糖基化蛋白呈現(xiàn)紫紅色條帶,可看出添加不同濃度衣霉素對(duì)木聚糖酶N-糖基化的抑制程度不同,隨著衣霉素添加量的增加重組木聚糖酶的抑制程度越高,位于45 kDa的主條帶紫紅色變淺,而低于45 kDa的紫紅色條帶逐漸增多,但是衣霉素的添加并不能完全抑制糖鏈連接到蛋白上以至存在不同程度的N-糖基化。

圖8 添加不同濃度衣霉素的XynA粗酶液的糖染色電泳圖Fig.8 PAS of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin注:M為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker;泳道1～5：GS115/ pPIC9K-xynA衣霉素添加量分別為0、2、5、10、15 μg/mL。

2.4 抑制糖基化前后木聚糖酶酶學(xué)特性分析

2.4.1 pH對(duì)重組木聚糖酶活力的影響 由圖9可知,GS115/pPIC9K-xynA最適反應(yīng)pH為5.0,于pH3.5～5.0之間可保持40%以上的相對(duì)酶活力,在pH7.5～10.0時(shí)相對(duì)酶活不足10%,本實(shí)驗(yàn)?zāi)揪厶敲富騺?lái)源于枝鏈霉菌L2001,天然菌株表達(dá)兩種分子量的木聚糖酶XynA和XynB,其中木聚糖酶XynA木聚糖酶在偏酸性的pH下(即pH5.0～7.0)比較穩(wěn)定,相對(duì)酶活力都保持在60%以上[26],綜上結(jié)果,重組木聚糖酶GS115/pPIC9K-xynA并不適合堿性環(huán)境;而添加不同濃度衣霉素的木聚糖酶最適反應(yīng)pH并未發(fā)生改變?nèi)詾?.0,酶的最適pH受到蛋白質(zhì)微環(huán)境以及氨基酸相互作用的多重影響[27],衣霉素抑制N-糖基化可能并沒(méi)有引起木聚糖酶催化殘基pKa值的改變，因此最適pH并沒(méi)有發(fā)生改變;但其相對(duì)酶活力在pH2.0～5.0之間隨著衣霉素添加量的增加而有所降低,這可能是由于抑制N-糖基化后木聚糖酶的酶活力降低而引起的。

圖9 不同濃度衣霉素對(duì)XynA最適pH的影響Fig.9 The optimal pH of XynA treated with different concentration of tunicamycin

由圖10可知,添加不同濃度衣霉素的重組木聚糖酶在pH2.5～10.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活力均能保留50%及以上,具有較好的穩(wěn)定性;由于不同緩沖體系的緩沖能力有一定的范圍,同一pH不同緩沖體系的緩沖能力不同,對(duì)木聚糖酶的酶活力和穩(wěn)定性產(chǎn)生了一定的影響。因此,N-糖基化對(duì)重組木聚糖酶XynA在不同pH下的活力和蛋白穩(wěn)定性無(wú)明顯影響。

圖10 不同濃度衣霉素對(duì)XynA pH耐受力的影響Fig.10 Tolerance of XynA under different pH buffers from 2.0 to 10.0 treated with different concentration of tunicamycin

2.4.2 溫度對(duì)重組木聚糖酶活力的影響 由圖11可知,XynA的最適反應(yīng)溫度為65 ℃,并且在50～75 ℃間可保持50%以上的相對(duì)酶活力,經(jīng)測(cè)定XynA在最適反應(yīng)溫度65 ℃時(shí)酶活為406.6 U/mL;添加不同濃度的衣霉素時(shí),重組木聚糖酶最適反應(yīng)溫度均下降為60 ℃,與未添加組相比,添加衣霉素的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度和比酶活均有所降低,且隨著添加量的增加下降更加明顯。這一結(jié)果表明N-糖鏈的修飾作用對(duì)木聚糖酶的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響,進(jìn)而影響了酶分子對(duì)溫度的耐受性。王茜[11]通過(guò)脫糖基化酶Endo H去除重組植酸酶phy(QF)的糖鏈,發(fā)現(xiàn)糖基化的植酸酶與未糖基化的植酸酶相比最適溫度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃。因此,N-糖基化對(duì)XynA在不同溫度下的活力有明顯影響。

圖11 不同濃度衣霉素對(duì)XynA最適溫度的影響Fig.11 The optimal temperature of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.3 重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 由圖12可知,在低于55 ℃時(shí),重組木聚糖酶XynA的相對(duì)酶活可以保持在35%以上,但隨著溫度的增加,穩(wěn)定性逐漸降低,在65～75 ℃時(shí),重組木聚糖酶XynA的相對(duì)酶活力不足5%,在80 ℃以上則可保留10%左右,而且衣霉素的添加也會(huì)降低酶的溫度穩(wěn)定性,但并不明顯。Guo[12]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃處理10 min可維持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃處理10 min酶活劇烈下降。柯濤[28]等在Pichia pastoris GS115中表達(dá)嗜熱酸性α-淀粉酶BD5088,發(fā)現(xiàn)糖基化修飾后的酶在100 ℃條件下熱處理1 h仍具有80%以上的酶活力、最適反應(yīng)溫度由80 ℃增加到90 ℃。Guo[29]等發(fā)現(xiàn)N-糖基化可增加抗胰蛋白對(duì)于熱的穩(wěn)定性。

圖12 不同濃度衣霉素對(duì)XynA耐熱穩(wěn)定性的影響Fig.12 Thermal stability of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.4 離子濃度及螯合劑對(duì)木聚糖酶活性的影響 如圖13所示,金屬離子Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+對(duì)重組木聚糖酶XynA有一定的激活作用;Cu2+及螯合劑EDTA對(duì)酶具有一定的抑制作用,其中Cu2+影響最明顯,酶活僅殘留23%;添加不同濃度衣霉素的重組木聚糖酶則表現(xiàn)出與未添加不同的結(jié)果,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA同樣具有一定激活作用,但并未隨著衣霉素濃度的增加而逐漸增強(qiáng),Ba2+則表現(xiàn)出一定抑制作用,且隨著衣霉素濃度的升高而逐漸降低。推測(cè)是因?yàn)榛诿傅鞍椎亩?jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu),多肽的折疊纏繞肽鏈中的氨基酸殘基的一定側(cè)鏈就以一定的幾何形式配置在金屬離子周?chē)?由于暴露的氨基酸殘基數(shù)目和位置不同,所以與金屬離子的結(jié)合形式也不同,衣霉素的添加會(huì)導(dǎo)致酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中翻譯后折疊過(guò)程中糖鏈不能很好地結(jié)合在Asn殘基上,從而對(duì)酶的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,導(dǎo)致酶與離子結(jié)合部位的幾何形式發(fā)生變化,最終導(dǎo)致酶分子耐受離子能力改變[30]。

圖13 不同濃度衣霉素對(duì)XynA 耐受金屬離子及EDTA的影響Fig.13 Tolerance of XynA under different metal ions and EDTA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)木聚糖酶活力的影響 由圖14所示,重組木聚糖酶XynA對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受力有所不同,對(duì)胰蛋白的耐受力要好于胃蛋白酶,衣霉素添加量為0、2、5、10 μg/mL時(shí)胰蛋白酶對(duì)酶活力影響較小,而添加量為15 μg/mL時(shí),酶活損失24%;而胃蛋白酶對(duì)木聚糖酶活力的抑制隨著衣霉素添加量的增加而減小,當(dāng)添加量為5、10、15 μg/mL時(shí)剩余酶活力分別為64%、63%、64%,基本無(wú)明顯差異,仍能保留50%以上。蛋白質(zhì)表面的糖鏈還可覆蓋蛋白質(zhì)分子中的某些蛋白酶降解位點(diǎn),從而增加蛋白質(zhì)對(duì)于蛋白酶的抗性[31],同時(shí)還可以防止蛋白質(zhì)的相互聚集[32]。

圖14 不同濃度衣霉素對(duì)XynA 耐受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影響Fig.14 Tolerance of XynA under Pepsin and Trypsin treated with different concentration of tunicamycin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)階段添加不同濃度N-糖基化抑制劑——衣霉素,來(lái)考察N-糖基化對(duì)木聚糖酶分泌表達(dá)、酶學(xué)特性的影響。經(jīng)不同濃度衣霉素的作用,對(duì)菌株畢赤酵母的生長(zhǎng)基本無(wú)影響,但隨著衣霉素添加量的增加木聚糖酶酶活力逐漸降低,主條帶逐漸變淺,說(shuō)明N-糖基化修飾對(duì)木聚糖酶正確折疊分泌表達(dá)有著重要的作用;衣霉素的添加并未對(duì)最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,最適反應(yīng)pH為5.0,于pH3.5～5.0之間可保持40%以上的相對(duì)酶活力;而最適反應(yīng)溫度在衣霉素添加量大于2 μg/mL時(shí)下降了5 ℃,且溫度穩(wěn)定性也有所下降;較未添加衣霉素組,不同濃度衣霉素添加組中Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA具有一定激活作用,Ba2+具有抑制作用;衣霉素的添加抑制了木聚糖酶上N-糖鏈的正常附著,抗蛋白酶水解的能力有所下降。以上結(jié)果表明,N-糖基化修飾有利于提高木聚糖酶XynA的分泌表達(dá)量,且對(duì)酶的熱穩(wěn)定性有積極作用。

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