抑制芽孢桿菌乳酸菌的篩選鑒定及其抗菌物質的分離純化

趙圣明,曹雪珂,趙巖巖,馬漢軍,何鴻舉

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

芽孢桿菌屬是存在于乳制品、罐裝食品、肉制品和面制品中的一類常見細菌,常引起食品腐敗甚至是食源性疾病的發生[1-5]。因其產生的芽孢具有高度的抗逆性,在巴氏殺菌條件下不能夠完全被殺死,當環境適宜時,芽孢重新萌發,微生物迅速繁殖,因此引起包裝食品腐敗變質的微生物主要是芽孢桿菌屬。研究表明枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌等能夠引起年糕的粘液化[6];嗜熱脂肪地芽孢桿菌存在于蔬菜及肉類罐頭中導致平酸敗壞[7,8];凝結芽孢桿菌導致桶裝番茄醬脹罐等[9]。此外還有一些食品中的芽孢桿菌屬和梭菌屬具有致病性,如存在于豆類食品、肉制品、焙烤食品中的蠟樣芽孢桿菌能夠產生腸毒素導致人嘔吐腹瀉[10];罐裝食品中污染的肉毒梭菌能夠產生世界上最強的毒素之一肉毒桿菌毒素,可麻痹人體神經甚至導致死亡[11]。因此,如何抑制食品中芽孢桿菌將逐漸成為食品保鮮研究領域的一個熱點。

乳酸菌在正常的生長代謝條件下可以生成多種具有抑菌作用的物質如有機酸、雙乙酰、3-羥基丁酮、過氧化氫、羅伊氏素和細菌素等[12]。乳酸菌在自然界中分布非常廣泛,一般營養豐富的自然環境中,如乳制品、發酵肉制品、發酵蔬菜、發酵果汁、青貯飼料、腐爛的植物、水果、下水道以及人類和動物的消化道、口腔等都能分離獲得乳酸菌[13-16]。以前的許多研究都報道了從這些環境中分離得到了具有特異性抑菌作用的乳酸菌菌株,例如杜靜芳等從鯉魚腸道中分離獲得1株對阪崎腸桿菌具有顯著抑菌效果的植物乳桿菌LY-4[17];Rafael等從涂抹干酪中分離獲得1株對單增李斯特菌具有顯著抑制效果的米酒乳桿菌2a[18];Zhu等從新鮮牛乳中分離獲得一株對金黃色葡萄球菌具有顯著抑制效果的植物乳桿菌ZJ008[19];王剛等從泡菜、發酵奶酒和嬰兒糞便中分離獲得11株對空腸彎曲桿菌具有顯著抑制效果的乳酸菌菌株,其中1株唾液乳桿菌ZX5的抑菌效果最強[20]。吉林省東部地區與朝鮮接壤,居住著大量的朝鮮族居民,以傳統方法腌制的辣白菜等自然發酵泡菜是朝鮮族的特色發酵食品,同時也是朝鮮族居民一日三餐不可缺少的佐餐食品。但是目前為止還未有關于朝鮮族辣白菜中產廣譜抑制芽孢桿菌細菌素的乳酸菌被報道,因此從朝鮮族傳統食品辣白菜中分離得到具有抑制芽孢桿菌乳酸菌菌株具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吉林省朝鮮族農家自制辣白菜 樣品取回后貯藏于4 ℃冰箱備用;蠟樣芽孢桿菌(AS 1.1846)、枯草芽孢桿菌(ATCC 9943)、凝結芽孢桿菌(CICC 20138)、巨大芽孢桿菌(CICC 10448)、短小芽孢桿菌(CICC 63202)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(CICC 20139)、多粘類芽孢桿菌(CGMCC4314)、生孢梭菌(CICC 10385)、產氣莢膜梭菌(CICC 22949)、艱難梭菌(CICC 22951) 為本實驗室保存;革蘭氏染色試劑盒 杭州百思生物技術有限公司;細菌基因組提取試劑盒購自美國 OMEGA公司;pMD19-T連接試劑盒、Taq Mix 南京諾唯贊生物公司;DNA凝膠回收試劑盒、柱式質粒提取試劑盒 大連TaKaRa公司;DNA標準分子量Marker 南京金斯瑞生物公司;Sephadex LH-20 美國Phamarcia公司;其他試劑 均為國產分析純。

Sartious AY-120電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司;TOMY-SX-700全自動高壓滅菌鍋 日本Tomy公司;SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州蘇凈集團;Centrifuge 5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;PTC-100TMPCR儀 美國MJ Research公司;PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司;pH計Orion 3 STAR 美國Thermo公司;JS-380C全自動數碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司;Agilent 1100 series高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Eclipse 80i光學顯微鏡 日本Nikon公司;HYL-A多功能搖床 太倉強樂實驗儀器有限公司;電腦自動部分收集器DBS-100 上海滬西分析儀器公司;Thermo-Fisher LTQ Orbitrap高分辨質譜儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 乳酸菌分離培養基(MRS培養基):牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,乙酸鈉5 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸氫銨2 g,七水硫酸鎂0.58 g,四水硫酸錳0.25 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,蒸餾水1 L,pH6.2～6.4,115 ℃、20 min滅菌備用,固體培養基另加1.5%～2%的瓊脂。指示菌培養基:LB培養基:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1 L,pH7.0,121 ℃、20 min滅菌備用,固體培養基另加1.5%～2%的瓊脂;厭氧梭菌培養基:牛肉膏10 g,蛋白胨5 g,酵母粉3 g,葡萄糖5 g,淀粉1 g,氯化鈉5 g,醋酸鈉3 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,蒸餾水1 L,pH6.8,121 ℃、20 min滅菌備用,固體培養基另加1.5～2%的瓊脂。乳酸菌鑒定用培養基:乳酸菌菌株鑒定所用到的培養基包括PYG培養基,精氨酸產氨培養基,產硫化氫培養基等均參照凌代文《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》配制[21]。

1.2.2 樣品的采集 使用滅菌的鑷子采集少量辣白菜樣品置于無菌采樣袋中,迅速放于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 辣白菜樣品中乳酸菌菌株的分離 稱取10 g辣白菜樣品放入250 mL盛有90 mL滅菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中,37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養2 h,使辣白菜中的乳酸菌充分溶解到生理鹽水中。然后將樣品進行10倍的梯度稀釋,最后選擇10-3、10-4、10-5的稀釋梯度各取0.1 mL涂布到含有0.3%碳酸鈣的MRS固體培養基中,37 ℃的培養箱中倒置培養48 h。之后選取具有鈣溶圈明顯的單菌落分別劃線于固體MRS培養基平板上,培養24 h后,進一步通過過氧化氫酶測試以及革蘭氏染色,選取過氧化氫酶測試呈陰性,革蘭氏染色陽性的單菌落,-80 ℃條件下保存備用[22]。

1.2.4 產抑制芽孢桿菌活性物質菌株的初篩 將分離得到的乳酸菌菌株分別劃線于MRS固體培養基平板上,37 ℃培養48 h后,以無菌打孔器于生長菌落旁取出5 mm直徑的瓊脂塊,分別貼放瓊脂塊于含有蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的指示平板表面,37 ℃培養12 h后測定抑菌圈直徑大小[23]。

1.2.5 產抑制芽孢桿菌活性物質菌株的復篩 將初篩得到的具有抗菌活性菌株按1%體積比接種于MRS液體培養基中,37 ℃靜止培養48 h后,4 ℃條件下90000×g離心30 min獲得發酵上清液,上清液經0.45 μm孔徑的細菌濾器過濾并排除過氧化氫抑制和有機酸抑制后,采用瓊脂孔擴散法[24]測定其抗菌活性。

1.2.6 菌株鑒定 菌株的形態特征、培養特征及生理生化鑒定 對獲得的活性菌株進行生理生化鑒定,具體方法參考《伯杰氏系統細菌學手冊》[25]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[21]。

基于16S rDNA基因的分子生物學鑒定 選取目標乳酸菌菌株對數期菌體選用OMEGA公司的細菌基因組提取試劑盒提取菌株總DNA。選用原核生物16S rDNA擴增的通用引物,正向引物:fD1 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物:rP1 5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′[26]。PCR擴增反應體系:正向和反向引物各1 μL,PCR Taq mix 12.5 μL,DNA模板1 μL,超純水9.5 μL,總反應體系25 μL。PCR反應循環:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后,割膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序得到的16S rDNA基因序列登陸GenBank數據庫進行BLAST同源性比較,應用MEGA 5.05軟件以neighbor-joining method構建系統發育樹。

1.2.7 乳酸菌產抑制芽孢桿菌活性物質的粗提取 將篩選得到的乳酸菌接種到MRS液體培養基中,37℃靜止發酵36 h后得到發酵液,然后4 ℃、12000 r/min離心10 min,取上清,分別選用不同的有機溶劑(正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮)對發酵上清液中的抑菌活性物質進行萃取。有機溶劑與發酵上清液的體積比為3∶1,經4 h的振蕩萃取后,靜置過夜,分離獲得有機相,經50 ℃真空旋蒸,將旋干后得到的產物用甲醇復溶后,用1 mol/L NaOH調pH到6.5,經5.0 g/L的過氧化氫酶37 ℃處理2 h后即獲得抑菌活性物質的粗提物。以蠟樣芽孢桿菌為指示菌,檢測其抑菌活性[27]。

1.2.8 乳酸菌產抑制芽孢桿菌活性物質的分離純化 采用Sephadex LH-20凝膠層析對抑菌活性物質的粗提物進行層析純化。純化條件為:將2 mL細粗提液上樣于Sephadex LH-20柱表面,采用色譜級甲醇和純水(體積比為80∶20)進行洗脫,洗脫流速為3 mL/min,利用電腦自動收集器收集組分。以蠟樣芽孢桿菌為指示菌,通過檢測其抑菌活性,收集得到的抑菌活性組分經濃縮后利用半制備型反向高效液相色譜進行進一步純化。樣品經0.22 μm微孔濾膜過濾后,利用Waters制備液相色譜XBridgeTMprep C18柱進行分離純化。純化條件為:洗脫液為含0.1%體積的三氟乙酸的水和乙腈溶液(水和乙腈體積比為95∶5)等濃度洗脫,時間50 min;進樣量1.5 mL;流速5 mL/min;檢測波長210 nm。收集半制備液相色譜洗脫組分做抑菌實驗,將抑菌活性組分濃縮后利用反高效液相色譜Acchrom XCharge C18柱(4.6 mm×250 mm)進行最后一步分離純化,純化條件:洗脫液為含0.1%體積的三氟乙酸的水和乙腈溶液(水和乙腈體積比為95∶5)等濃度洗脫,時間:50 min;進樣量:20 μL;流速:0.3 mL/min;檢測波長:210 nm。收集具有抑菌活性的液相色譜洗脫組分儲存于-20 ℃備用。

1.2.9 抑制芽孢桿菌活性物質的高分辨質譜分析 采用高分辨電噴霧電離質譜(HR-ESI-MS)反向C18質譜柱(2.1 mm×100 mm×3 μm)測定抑菌活性組分的分子質量。檢測條件:流動相A為純水,流動相B為乙腈+2‰甲酸,梯度變化條件:0%～10 min,A 95%～95%,B 5%～5%;10～18 min,A 95%～5%,B 5%～95%;18～22 min,A 5%～5%,B 95%～95%。時間22 min;進樣量20 μL;流速0.2 mL/min;檢測波長210 nm。

質譜檢測條件:離子源:電噴霧電離(ESI);離子源溫度:110 ℃;霧化氣:氦氣;溶劑溫度:250 ℃;傳輸電壓:70 V;噴霧壓力:40 psi;電離模式:正離子模式;正離子毛細管電壓:3500 V;正離子錐孔電壓:25 V;毛細管溫度:300 ℃;APCI汽化溫度:45 ℃;選擇離子掃描范圍m/z在500～2000。

1.2.10 抑制芽孢桿菌活性物質蛋白酶穩定性研究 分別配制胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶各酶溶液的濃度為5 mg/mL,取0.1 mL酶溶液分別加入0.4 mL經半制備型反向高效液相色譜分離純化獲得的抑菌活性組分,調節至各個酶的最適合pH(胃蛋白酶2.0,堿性蛋白酶9.5,木瓜蛋白酶6.5,α-胰凝乳蛋白酶7.5),搖勻,37℃水浴處理3 h后,以0.1 mol/L的NaOH調節pH至4.0,然后分別測定其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性,以未加蛋白酶處理,pH調至4.0的樣品為對照。

1.2.11 抑制芽孢桿菌活性物質抑菌活性測定 采用經半制備型反向高效液相色譜分離純化獲得的抑菌活性組分,利用瓊脂孔擴散法測定其對芽孢桿菌的抑菌活性,指示菌株包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、生孢梭菌、產氣莢膜梭菌、艱難梭菌。

1.2.12 數據處理 實驗數據處理采用SPSS 20.0軟件,所有實驗重復3次,結果以平均值±標準差表示,顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 產抑制芽孢桿菌活性物質菌株的篩選

以吉林省朝鮮族特色食品辣白菜為篩選樣品一共獲得產酸的革蘭氏陽性菌株376株。采用瓊脂塊法初篩共獲得34株對蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌具有較好抑菌活性的菌株。采用三角瓶發酵瓊脂孔擴散方法進行復篩,排除酸和過氧化氫的影響,最終篩選出5株對枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、生孢梭菌、產氣莢膜梭菌、艱難梭菌抑菌效果較好的菌株,菌株編號分別為SL-21、JS-8、JLK-36、JLK-53、JLY-7,見表1。其中編號為JLY-7的菌株分離自吉林省延吉市的農家自制辣白菜,比較5株菌中JLY-7具有最好的抑菌活性,因此本實驗選取該菌株繼續下一步實驗。

表1 菌株發酵液對指示菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of cell-free supernatant of strains

2.2 菌株的形態特征及生理生化鑒定

菌株JLY-7在MRS固體培養基上培養24 h后菌落圓潤,邊緣整齊無鋸齒狀,呈乳白色,表面光滑不透明,具有乳酸菌典型的生長特征。經革蘭氏染色和顯微鏡觀察菌體確定該菌是革蘭氏陽性菌,菌體形狀呈短桿狀,無鞭毛和芽孢。

菌株生理生化結果如表2所示,不能發酵葡萄糖產氣,不能液化明膠,不能還原硝酸鹽,不能水解精氨酸產氨,接觸酶實驗呈陰性,糖發酵實驗結果表明該菌株能發酵利用除了鼠李糖指紋所有選用的糖類(表2)。這與已報道的植物桿菌SD-7的生理生化結果一致[28]。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》的描述,將該菌株JLY-7初步鑒定為植物乳桿菌。

表2 生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain JLY-7

2.3 菌株的分子生物學鑒定

利用OMEGA細菌基因組提取試劑盒提取菌株JLY-7的基因組DNA,電泳檢測結果見圖1(A)。以菌株的基因組作為擴增模板,利用細菌16S rDNA通用引物擴增得到約1.6 kbp的擴增產物,結果見圖1(B)。將擴增產物回收后,送上海生工生物工程公司測序得到1583 bp堿基序列。將菌株JLY-7的16S rDNA基因序列經校對和拼接后在NCBI網站上利用BLAST程序與GenBank數據庫中的核酸數據進行同源性搜索比對,結果發現菌株JLY-7與植物乳桿菌的相似性達到了99%。選取與菌株JLY-7的序列相似較高的菌株16S rDNA基因序列構建系統發育樹,結果見圖2。結合形態學特征、生理生化實驗以及16S rDNA系統發育樹結果最終確定菌株JLY-7在細菌分類學上屬于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。近年來研究發現,發酵食品是篩選功能活性乳酸菌的一個優良資源,已經有許多產抑菌物質的植物乳桿菌被分離到,例如:LactobacillusplantarumC19[30]、LactobacillusplantarumZJ008[31]、Lactobacillusplantarum163[22]和LactobacillusplantarumZJ5[32]等,本研究從朝鮮族辣白菜中篩選得到的植物乳桿菌JLY-7具有良好的抑制芽孢桿菌活性,對該菌株的抑菌物質進一步研究具有一定的科學價值。

圖1 菌株JLY-7基因組DNA 和16S rDNA的PCR擴增電泳圖Fig.1 The electrophoresis map of the genomic DNA and PCR product of 16S rDNA of strain JLY-7注:M:DNA標準分子量,(A)1,2:基因組DNA,(B)1,2:16S rDNA。

圖2 基于16S rDNA基因序列的植物乳桿菌JLY-7菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum JLY-7注:所有菌株均為乳酸菌,分支節點的數值代表在1000重復數據的bootstrap值,線段0.005代表序列的差異度。

2.4 抑制芽孢桿菌活性物質的粗提取

將發酵液經過高速冷凍離心后收集無細胞上清液,經正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷和四氯化碳分別萃取后的抑菌活性結果見表3。這幾種有機溶劑均出現了明顯分層現象,其中正丁醇的萃取效果最好,有機相中萃取物具有顯著的抑菌效果,水相中抑菌活性物質殘留較少。正己烷和乙酸乙酯的萃取物具有較好的抑菌活性,但是水相中殘留的抑菌活性物質相對較多。三氯甲烷和四氯化碳有機相萃取物無抑菌活性,而水相中具有抑菌活性,說明三氯甲烷和四氯化碳對抗菌物質不具有萃取能力。乳酸菌產抗菌物質主要是細菌素類的短肽分子,同時具有疏水性和親水性,而本研究使用的有機溶劑中，正丁醇的疏水性和極性要高于其他有機溶劑,且正丁醇對抗菌物質的萃取效果最好,說明該抗菌物質的極性較大,更易溶于強極性溶劑。高鵬等[27]從多種有機溶劑中篩選出正丁醇和乙酸乙酯作為萃取劑對LactobacillusplantarumHLJ-174 產的抗菌物質進行粗提取,發現正丁醇的萃取效果要好于乙酸乙酯,本研究與之的研究結果相一致。因此本研究選用正丁醇對植物乳桿菌JLY-7發酵液中的抗菌物質進行粗提取。

表3 植物乳桿菌JLY-7發酵 上清液有機溶劑萃取后抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of cell-free culture supernatant of Lactobacillus plantarum JLY-7 treated by organic solvent

2.5 抑制芽孢桿菌活性物質的凝膠層析純化

經過正丁醇萃取得到的抗菌物質粗提物采用Sephadex LH-20凝膠層析進行純化,以蠟樣芽孢桿菌作為抑菌測試菌株,通過瓊脂孔擴散法對層析收集的樣品進行抑菌活性檢測,結果見圖3。由圖3可知,在收集管中的第34管至第48管之間得到一個具有抑菌活性的的洗脫組分,將其收集濃縮后用于下一步的分離純化。

圖3 植物乳桿菌JLY-7所產抗菌物質的 Sephadex LH-20洗脫曲線Fig.3 Elution curve of antimicrobial substance from Lactobacillus plantarum JLY-7 on Sephadex LH-20 gel

2.6 抑制芽孢桿菌活性物質的半制備型反向高效液相色譜純化

經過Sephadex LH-20凝膠層析純化后的組分經濃縮后采用半制備型反向高效液相色譜進一步純化得到7個明顯的洗脫峰,結果見圖4。將洗脫峰分別收集后以蠟樣芽孢桿菌作為抑菌測試菌株進行抑菌活性檢測,其中只有出峰時間在6.25 min的2號洗脫峰具有明顯的抑菌活性,將其收集后濃縮用于下一步純化。

圖4 Sephadex LH-20層析后抗菌物質的半制備型HPLC圖Fig.4 Semi preparative HPLC analysis of antimicrobial substance after purified by Sephadex LH-20

2.7 抑制芽孢桿菌活性物質的反向高效液相色譜純化

圖5為經半制備型反向高效液相色譜純化獲得的抑菌活性組分，采用反向高效液相色譜進一步純化的圖譜,通過對各洗脫峰的抑菌活性檢測發現,只有在出峰時間12.18 min的洗脫峰具有明顯的抑菌活性,如圖5所示,說明經過一系列的分離純化步驟,本研究已經成功的獲得純度較高的抑菌活性物質,將該組分收集后用于下一步的分子量鑒定。

圖5 抗菌物質純化后的HPLC圖Fig.5 HPLC assay of the purified antimicrobial substance

2.8 抑制芽孢桿菌活性物質的分子量測定

將反向高效液相色譜純化獲得抑菌活性組分收集后采用液質聯用(LC-HR-ESI-MS)首先檢測樣品的純度,由圖6的結果可以看出,液相色譜分離得到的組分在2.32 min具有單一洗脫峰,周圍無明顯的的雜峰,且所對應的質譜響應結果也為單一的質譜峰,說明前期收集獲得的抑菌活性組分純度較高,幾乎無其他雜質。進一步通過高分辨質譜(HR-ESI-MS)進行分析測定細菌素的分子量,結果見圖7。由圖7可知,出現了明顯的單一質譜峰,分子量的計算方式為M+H=圖中所得峰值,因此該抗菌物質的分子量應為694.129 Da。

圖6 HPLC純化后的抗菌物質的LC-MS圖Fig.6 LC-MS spectrum of the antimicrobial substance after purified by HPLC注:a:質譜響應圖;b:液相色譜分離圖。

圖7 HPLC純化后抗菌物質的高分辨電噴霧質譜圖Fig.7 HR-ESI-MS spectrum of the antimicrobial substance after purified by HPLC

2.9 抑制芽孢桿菌活性物質蛋白酶穩定性研究

將純化得到的抑菌活性物質分別經胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶37 ℃度水浴處理3 h,抑菌結果見表4,從表4中可以看出,與對照組相比,經這幾種蛋白酶處理后對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性完全消失,表明該抗菌物質對常見的蛋白酶均非常敏感,因此可知植物乳桿菌JLY-7產的抗菌物質具有蛋白性質,參考以前的文獻研究報道[33],可以初步判定植物乳桿菌JLY-7產的抑菌物質為細菌素類。

表4 植物乳桿菌JLY-7產抗菌物質的蛋白酶穩定性Table 4 The stability of antimicrobial substance from Lactobacillus plantarum JLY-7 for different enzymes treatments

2.10 抑制芽孢桿菌活性物質的抑菌活性

瓊脂孔擴散實驗結果如圖8所示,結果表明經半制備型反向高效液相色譜分離純化獲得的抑菌活性組分對食品中常見的一些致病性和腐敗性芽孢桿菌具有顯著的抑制作用,包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、生孢梭菌、產氣莢膜梭菌和艱難梭菌。

圖8 植物乳桿菌JLY-7產抗菌物質的抑菌活性Fig.8 The inhibitory activity of antimicrobial substance from Lactobacillus plantarum JLY-7注:a:蠟樣芽孢桿菌;b:枯草芽孢桿菌;c:凝結芽孢桿菌; d:巨大芽孢桿菌;e:短小芽孢桿菌;f:嗜熱脂肪地芽孢桿菌; g:多粘類芽孢桿菌;h:生孢梭菌; i:產氣莢膜梭菌;j:艱難梭菌。

3 結論

本研究從吉林省朝鮮族傳統食品辣白菜中篩選鑒定得到1株LactobacillusplantarumJLY-7。對該菌株發酵液中抗菌物質采用正丁醇進行粗提取,選用Sephadex LH-20凝膠層析和反向高效液相色譜等手段進一步純化最后得到1種分子量為694.129 Da的細菌素,該細菌素對食品中常見的腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較好的抑制作用。在以后的研究中可以對細菌素的分子結構、編碼基因、表達調控等方面進一步深入分析,為開發新型的具有控制食品中芽孢桿菌污染的益生發酵菌株奠定理論基礎。

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