山杏內種皮磷脂類化合物提取工藝研究

紀麗麗,鮑宇宏,張曉旭,那 娜,于丹梅,韓 雪,劉偉強

(1.黑龍江林業(yè)職業(yè)技術學院,生態(tài)工程學院,黑龍江牡丹江 157000; 2.青島黃海學院,護理與健康學院,山東青島 266000)

磷脂是含磷酸基的類脂化合物,是組成生物膜的主要成分,是生命的基礎物質之一,在生命過程中起結構形成作用和代謝作用。磷脂具有促進脂肪代謝、改善脂質代謝和調節(jié)膜酶活性等生理功能,是具有保健功能的食品添加劑。另外,磷脂具有乳化性,是工業(yè)中重要的表面活性劑和乳化劑[1]。磷脂主要是從動物腦組織、禽類蛋黃以及油料植物種子中提取[2]。常見磷脂提取方法有溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、金屬沉淀法、超臨界CO2流體萃取法、膜分離法和酶催化法等,磷脂分析檢測方法有薄層色譜分離法、柱色譜分離法、高效液相色譜法和核磁共振法等[3]。其中,微波輔助萃取法是基于微波場瞬時穿透性加熱的原理而應用于有效成分提取的方法,該方法使目標組分在微波場作用下迅速生成大量的熱能,加速目標組分由固體內部向固液界面擴散的速率[4]。微波輔助萃取技術具有溶劑用量少、操作時間短、提取率高等特點[5],廣泛應用于多種天然產物的提取[6-7]。

山杏(Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne)在北方地區(qū)分布廣泛,是重要的經濟林和造林樹種,山杏的開發(fā)利用主要有山杏蛋白、山杏油、苦杏仁苷等[8]。種皮是杏仁加工時產生的下腳料,目前有以山杏種皮為材料提取黑色素[9]、總多酚[10]等化合物的研究,未見有提取磷脂的報道。本文利用微波輔助萃取法,研究山杏內種皮磷脂類化合物的提取工藝,并通過正交實驗優(yōu)化工藝參數(shù),以高效液相色譜-紫外檢測器法分離測定磷脂類化合物,為山杏的綜合利用提供技術指導,提高產品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏仁 購自牡丹江市農貿市場,經黑龍江林業(yè)職業(yè)技術學院張樹寶教授鑒定;磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)標準品 Sigma公司;磷酸二氫鉀、鉬酸銨、抗壞血酸、無水醋酸鈉、高氯酸 天津市凱通化學試劑有限公司;甲醇、乙腈、無水乙醇、正己烷 天津市大茂化學試劑廠;濃硝酸、氯仿 天津市津科精細化工研究所;液相色譜所用試劑 為色譜純;其他試劑 為分析純。

MCR-3微波化學反應器 上海丞伍儀器科技有限公司;LC-16高效液相色譜儀 日本島津公司;SPD-16檢測器 日本島津公司;Milli-Q Academic超純水儀 美國密理博公司;AR1140型電子天平 梅特勒-托利多公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司;T6紫外-可見分光光度計 上海普析通用儀器有限公司;TGL16M型高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司;DGG-9023A電熱恒溫真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;HH-S-21-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精科儀器有限公司;JP-500C粉碎機 永康市久品工貿有限公司;D8-XAB電熱板 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 磷顯色液:鉬酸銨1.25 g,無水醋酸鈉4.10 g,蒸餾水溶解,定容至500 mL,與10%抗壞血酸水溶液按體積比9∶1混合;消化劑:高氯酸-硝酸體積比1∶4混合液。

1.2.2 磷標準曲線的建立 精密稱取磷酸二氫鉀0.0500 g,去離子水溶解,配制成標準磷溶液,此標準溶液中磷濃度為0.2275 mg/mL。分別吸取標準磷溶液5、10、20、30、40、50 μL,置具刻度試管中,加入0.25 mL消化劑,消化至液體無色,加入顯色液定容至5 mL,65 ℃水浴顯色10 min,紫外-可見分光光度計于820 nm處,測定吸光度[11]。以標準磷溶液的濃度為橫坐標(X),以吸光度為縱坐標(Y),標準曲線方程為Y=0.1906X+0.0113,線性相關系數(shù)為0.9998,磷濃度在0.2275～2.275 μg/mL范圍內,線性關系良好。

1.2.3 總磷脂得率測定 經過預實驗,選擇正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)為萃取試劑。準確稱取山杏內種皮粉末1.000 g,置于溶樣杯中,加入一定量的萃取試劑,在一定的萃取溫度下,以一定的微波功率萃取一段時間。萃取結束后,6000 r/min離心10 min,上清液定容到25 mL。取5 mL于錐形瓶中,40 ℃水浴蒸干溶劑,另取一只錐形瓶為空白,分別加入10 mL消化液,低溫加熱,待黃煙冒盡后,升高溫度,待溶液澄清時,停止加熱。冷卻至室溫后,分別用顯色液定容至5 mL,65 ℃水浴恒溫10 min,冷卻后以空白調零,于820 nm波長處測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算測定樣品中磷的含量,再根據(jù)公式計算總磷脂得率[12-14]。

總磷脂得率(%)=X×V2×25/(V1×W×106)×100

式中:X為測定樣品中磷元素質量(μg);V1為測定時吸取樣品的體積(mL);V2為樣品提取液的總體積(mL);W為樣品的稱樣量(g);25為磷轉換成磷脂的系數(shù)。

1.2.4 單因素實驗 從萃取溫度、萃取時間、微波功率、料液比四個方面進行單因素實驗,考察其對總磷脂得率的影響[15-17]。

1.2.4.1 萃取溫度對總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波時間15 min,考察萃取溫度30、35、40、45、50、55 ℃對總磷脂得率的影響。

1.2.4.2 萃取時間對總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波溫度45 ℃,考察萃取時間5、10、15、20、25、30 min對總磷脂得率的影響。

1.2.4.3 微波功率對總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波溫度45 ℃,微波時間15 min,考察微波功率200、300、400、500、600、700 W對總磷脂得率的影響。

1.2.4.4 料液比對總磷脂得率的影響 微波功率300 W,微波溫度45 ℃,微波時間15 min,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)對總磷脂得率的影響。

1.2.5 正交優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎上,采用L9(34)表作正交實驗,考察萃取溫度、微波功率、萃取時間、料液比4個因素對磷脂得率的影響,確定微波輔助萃取山杏內種皮磷脂的最佳工藝條件[18]。正交實驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.6 磷脂類化合物標準溶液的配制 精密稱取磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)標準品,甲醇溶解并定容,得質量濃度為PC:1.6 mg/mL,PE:2.8 mg/mL,PG:1.6 mg/mL,LPC:2.0 mg/mL的標準品儲備液[19]。

1.2.7 制備磷脂樣品 稱取樣品1.000 g,正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)溶液25 mL,在微波溫度45 ℃,微波功率400 W條件下提取15 min,萃取結束后,6000 r/min離心10 min,取上清液,0.75%氯化鈉溶液萃取2次,收集有機相,旋轉濃縮至近干,甲醇定容至10 mL,取樣品溶液1 mL,甲醇稀釋至10 mL,0.45 μm微孔濾膜過濾,得待測樣品[20]。

1.2.8 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Rx-SIL柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為甲醇∶乙腈=85∶15 (mL/mL);等度洗脫;流速1 mL/min;進樣量20 μL;檢測波長205 nm[21-23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 微波萃取單因素實驗

2.1.1 萃取溫度對總磷脂得率的影響 萃取溫度對總磷脂得率的影響見圖1。由圖1可知,溫度升高,分子運動加速,磷脂類化合物的滲透、擴散、溶出速度加快,更易從細胞中轉移到提取試劑中,在50 ℃時磷脂得率最大,為0.0873%,再升高溫度時,由于磷脂類化合物對熱不穩(wěn)定,磷脂易發(fā)生分解,導致磷脂得率下降。

圖1 萃取溫度對總磷脂得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of phospholipids

2.1.2 萃取時間對總磷脂得率的影響 萃取時間對總磷脂得率的影響見圖2。由圖2可知,磷脂得率隨萃取時間的延長而增加,當萃取時間為15 min時,磷脂得率有最大值,為0.0821%,再延長萃取時間,磷脂得率呈下降趨勢。在較短時間內,微波對細胞結構破壞作用大,磷脂類化合物大量溶出,得率提高,而隨著細胞破碎程度的加大,其他雜質的溶出也增加,且受高溫影響,磷脂類化合物結構易發(fā)生改變,磷脂得率降低。

圖2 萃取時間對總磷脂得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of phospholipids

2.1.3 微波功率對總磷脂得率的影響 微波功率對總磷脂得率的影響見圖3。由圖3可知,隨著微波功率的增大,磷脂得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢,在400 W時磷脂得率達到最大值,為0.0899%。微波功率增大,微波能吸收增多,促進細胞破碎,磷脂類化合物溶出增加,但功率過大,可能破壞磷脂類化合物結構,導致磷脂降解,得率下降。

圖3 微波功率對總磷脂得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction yield of phospholipids

2.1.4 料液比對總磷脂得率的影響 料液比對總磷脂得率的影響見圖4。由圖4可知,料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)時,磷脂得率升高明顯,而料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)時,磷脂得率增長趨于緩慢。增大萃取溶劑量,原料浸提充分,磷脂得率增加,而繼續(xù)提高溶劑量,料液質量濃度差增幅逐漸降低,磷脂得率的增加也趨于平緩,從提取效果和降低成本方面考慮,料液比1∶25 (g/mL)最佳,此時磷脂得率為0.0886%。

圖4 料液比對總磷脂得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of phospholipids

2.2 正交實驗

設計正交實驗對磷脂類化合物提取工藝進行優(yōu)化,結果見表2。由表2可知,微波輔助萃取山杏內種皮磷脂類化合物的工藝中,各因素的影響主次順序為:萃取時間(B)>微波功率(C)>料液比(D)>萃取溫度(A),最佳工藝組合為A1B2C2D3,即料液比1∶25 (g/mL),萃取溫度45 ℃,微波功率400 W,萃取時間15 min。在優(yōu)化工藝條件下平行實驗3次,驗證工藝參數(shù)。山杏內種皮總磷脂得率為0.0977%±0.0015%,磷脂得率高且重復性好。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

對正交實驗結果進行方差分析,結果見表3。由表3可知,萃取時間對磷脂類化合物提取有顯著影響(p<0.05),微波功率、料液比和萃取溫度均未顯示出顯著差異性(p>0.05)。

表3 方差分析結果Table 3 Analysis results of variance

2.3 磷脂類化合物標準品色譜圖

分別吸取一定量的各磷脂標準品儲備液,甲醇定容得混合標準溶液。按實驗方法中色譜條件進行測定,4種磷脂類化合物標準品色譜圖如圖5所示。由圖5可知,本文建立的方法各標準品出峰時間較快,峰形較好,基線穩(wěn)定,分離度良好。PG、PE、PC及LPC標準品出峰時間分別為2.538、3.101、5.885 min及8.118 min。

圖5 標準品色譜圖Fig.5 Chromatograms of a mixed phospholipis standards注：1.PG;2.PE;3.PC;4.LPC。

2.4 標準曲線的繪制

分別取各磷脂標準品儲備液,甲醇稀釋,制成系列標準工作液,按實驗方法中色譜條件進行測定。橫坐標為標準品濃度,縱坐標為峰面積×106,進行線性回歸。以信噪比S/N=3計算檢出限。磷脂類化合物的線性方程、相關系數(shù)、測定范圍及檢出限見表4。由表4可知,各標準品標準曲線在測定范圍內線性關系良好。在信噪比為3∶1時,測得PE、PC、PG及LPC標準品最低檢測限分別為2.7、3.8、3.1 μg/mL及4.9 μg/mL。

表4 不同磷脂組分的線性方程Table 4 The linear regression equations of different phospholipids

2.5 精密度實驗

重復6次測混合標準品溶液,磷脂化合物峰面積的RSD值分別為PC:1.45%,PE:1.27%,PG:1.33%,LPC:0.94%,儀器精密度良好。

2.6 樣品測定

精密稱取一定量的山杏內種皮樣品,按樣品制備方法進行處理,在實驗方法中的色譜條件下測定,平行實驗6次,樣品色譜圖如圖6所示。由圖6可知,山杏內種皮磷脂中有PE,而PC、PG與LPC未檢測出。記錄樣品溶液PE的峰面積,取平均值,根據(jù)線性方程計算山杏內種皮PE含量為(0.3936±0.0082) mg/g。

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of sample

2.7 回收率實驗

稱取山杏內種皮樣品1.000 g置于10 mL容量瓶中,分別加入一定體積的磷脂酰乙醇胺標準品儲備液,處理樣品,高效液相色譜測定含量,結果見表5。由表5可知,PE加樣回收率在95.38%～98.56%之間,加樣回收率和RSD數(shù)據(jù)表明,本實驗方法對山杏內種皮中PE分析檢測具有良好的準確度。

表5 加樣回收率結果(n=6)Table 5 Spiked recoveries of different phospholipids(n=6)

3 結論

本文利用微波輔助萃取法提取山杏內種皮中磷脂類化合物,通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化微波輔助萃取條件。最優(yōu)條件為,微波溫度45 ℃,萃取時間15 min,微波功率400 W,料液比1∶25 (g/mL),測得山杏內種皮總磷脂得率為0.0977%±0.0015%。高效液相色譜法測的磷脂酰乙醇胺(PE)含量為(0.3936±0.0082) mg/g。本研究對山杏資源的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

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