真空厭氧間歇技術富集福鼎大白茶茶鮮葉GABA的參數(shù)優(yōu)化

沈 強,許凡凡,張小琴,潘 科,劉忠英,鄭文佳,*

(1.貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所,貴州貴陽 550006; 2.貴州民族大學人文科技學院,貴州貴陽 550025)

GABA(γ-氨基丁酸)是一種四碳非蛋白質組成的天然氨基酸,廣泛存在于動、植物及微生物中[1-3],在人體中具有降血壓、改善和治療糖尿病、抗癌功能、抗疲勞功能、改善腦功能,增強記憶力、調節(jié)激素分泌及控制哮喘病等眾多生理功能[4]。茶葉中也存在極少量的GABA,如綠、紅、青茶中僅含約0.01%～0.02%[5],研究表明,茶鮮葉在經過厭氧[6]、噴施葉面肥[7]、浸泡處理[8-9]、微生物發(fā)酵[10]及微波照射[11]等特殊技術處理后能夠積累大量的GABA,其中最為常用的是厭氧技術,常將CO2、N2、真空和間歇厭氧等處理作為茶葉中的厭氧處理條件。最早,日本津志田藤二郎[6]發(fā)現(xiàn)茶鮮葉在經過連續(xù)6 h充氮除氧處理后能積累大量的GABA,并以一種GABA含量在1.50 mg/g以上的新型降壓茶推向市場;此后,澤井佑典[12]發(fā)現(xiàn)采用間歇厭氧處理要比連續(xù)厭氧富集效果好。在我國,林智[13]發(fā)現(xiàn)將真空作為厭氧條件的處理效果要顯著優(yōu)于氮氣處理,郝強等[14-15]對真空處理設備進行了探索研究,結果證明采用此設備處理云南大葉茶種鮮葉后其GABA含量超過標準1.2倍以上。厭氧環(huán)境下,茶鮮葉中的谷氨酸脫羧酶(GAD)被激活,促進GAD催化L-谷氨酸(L-Glu)脫羧反應,生成大量的GABA。研究表明,氨基酸含量高或GAD(谷氨酸脫羧酶)酶活性高有利于GABA的積累[16]。不同嫩度的茶鮮葉其內含物質含量不同,Glu和GAD酶活性也不同,富集后GABA的含量也會有所不同。

因此,本文考慮到富集成本,采用富集效果好的厭氧間歇技術,以福鼎大白茶為研究對象,綜合考慮影響GABA含量的茶葉嫩度、真空度、厭氧時間及富集溫度等四個因素,采用正交實驗設計確定厭氧間歇技術富集不同等級茶鮮葉GABA的最佳條件,以期為生產高含量GABA茶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福鼎大白茶 貴州貴陽,鮮葉采摘標準為一芽一葉至一芽四葉不同等級,采摘時間為2016年7月;2,4-二硝基氟苯(FDBN)、γ-氨基丁酸標準品 美國Sigma公司,99%;四氫呋喃、甲醇、冰乙酸等 均為色譜醇;無水乙醇、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉、福林酚、茚三酮等 均為分析醇。

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司;DZ600-2S真空包裝機 海諾機械;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;微波爐 格蘭仕微波爐;HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司;UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津等。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同真空厭氧處理 稱取茶鮮葉200 g于鋁箔袋中,采用真空包裝機進行抽真空使其達到低氧厭氧環(huán)境,再通過解封進行室內攤晾使其達到有氧環(huán)境,設計不同的實驗處理。具體實驗處理如下:對照CK:未經真空厭氧處理的鮮葉200 g→80 ℃烘干固樣;處理1:鮮葉200 g→真空厭氧3 h→80 ℃烘干固樣;處理2:鮮葉200 g→真空厭氧3 h→有氧2 h→80 ℃烘干固樣;處理3:鮮葉200 g→真空厭氧3 h→有氧2 h→真空厭氧3 h→80 ℃烘干固樣;處理4:鮮葉200 g→真空厭氧6 h→80 ℃烘干固樣;處理5:鮮葉200 g→真空厭氧3 h→有氧2 h→真空厭氧3 h→有氧2 h→真空厭氧3 h→80 ℃烘干固樣;各處理茶樣均采用干研磨機磨碎茶樣,置于自封袋內,并做好標記,以待測備用。

1.2.2 正交實驗設計 在1.2.1中實驗結果的基礎上,采用一次真空厭氧間歇技術富集茶葉中GABA,確定影響GABA因素有厭氧時間,同時參考文獻[12-16]資料研究結果影響GABA因素的還有茶葉等級、真空度、富集溫度,設計了L16(45)正交實驗設計方案,因素水平表如下表1所示。

表1 正交實驗因素水平編碼Table 1 Code of factors and levels for orthogonal

1.2.3 鮮葉富集后的色澤及氣味判斷方法 實驗中判斷鮮葉富集后的色澤及氣味的方法主要采取感官方法,長期從事茶葉加工的人員5人組成,分別就處理樣品進行感官判斷。富集處理后茶鮮葉綠、青氣或略帶悶味,實際生產中可以接受;若富集處理后茶鮮葉出現(xiàn)大量黃變、紅葉紅梗、悶味重、悶臭味,則不符合實際生產要求。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 GABA含量測定 色譜柱:AgilentTC-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相:A相為5 mmol/L 醋酸鈉溶液(pH5.7,含5%四氫呋喃),B相為甲醇;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:360 nm;進樣量:20 μL[17]。

1.2.4.2 其他測定方法 茶葉中水分測定參照GB/T 8304-2013;茶葉中茶多酚測定參照GB/T 8313-2008;茶葉中游離氨基酸總量測定參照GB/T 8314-2013;茶葉中咖啡堿的測定方法參照GB/T 8312-2002。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗處理重復3次,用IBM SPSS Statistic 20.0軟件及Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)及Duncan法多重比較。實驗結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 FDBN柱前衍生高效液相色譜法測定GABA結果

由圖1可知,對GABA的單標進行測定后,結果發(fā)現(xiàn)GABA的出峰時間約在22.7 min左右,并經驗證在17.5 min左右出現(xiàn)的是溶劑峰。其中測得GABA的標準曲線為y=0.0533x+0.0562(R2=0.9997)線性較好。

圖1 GABA單標色譜圖Fig.1 GABA single chromatogram

圖2 GABA標準曲線Fig.2 The standard of GABA

2.2 不同真空厭氧處理對GABA含量的影響

針對不同真空厭氧處理對GABA富集含量的影響,本實驗做了5個處理,實驗結果如圖3所示,未經厭氧處理的茶葉中GABA的含量很低,僅為(0.21±0.02) mg/g,但經過厭氧處理后,每個處理的GABA含量與對照相比均有明顯的增加(p<0.05)。真空處理使茶鮮葉處于厭氧逆境狀態(tài)下,激活GAD酶,酶活性增加,從而促使GABA積累量增加。

圖3 不同真空厭氧處理茶鮮葉中GABA的含量Fig.3 GABA content of the tea leaf in different anaerobic condition注:圖中不同小寫字母表示經Duncan 差異顯著性檢驗在0.05水平差異顯著。

比較處理1、處理4可知,連續(xù)真空處理茶鮮葉6 h的GABA含量比連續(xù)處理3 h的要高出24%,但兩者之間并不存在顯著性差異(p>0.05)。茶鮮葉在連續(xù)6 h真空處理的過程中,其GABA的合成主要集中在前3 h,后3 h的GABA生成量明顯大幅減少,僅為0.28 mg/g,這可能與GAD的活性受底物谷氨酸(Glu)濃度調節(jié)有關,隨著厭氧時間的延長,Glu不斷減少,降低了GAD對其的利用,GABA的合成速度降低[18],說明并不是連續(xù)厭氧時間越長,GABA生成量就越多。

處理2在處理1的基礎上增加了2 h的有氧處理,GABA含量并無顯著變化(p>0.05);處理3在處理2的基礎上又真空處理3 h后,使其真空厭氧時間達到6 h,GABA增加到(2.05±0.12) mg/g,與處理4連續(xù)真空處理6 h相比,GABA增加了44%,差異顯著(p<0.05)。說明在厭氧處理時間后,適當增加一定的有氧時間,可以提高茶鮮葉中的GABA含量。這與Glu在一定范圍內的攤放前期是呈上升趨勢有關[19-20]。

處理5在處理3的基礎上,對茶鮮葉又增加了一次真空厭氧處理3 h、有氧處理2 h的循環(huán),因而鮮葉累計處理時間達到13 h,其中厭氧處理時間為9 h,茶葉中GABA的含量高達(2.43±0.18) mg/g,比處理3高出19%,但變化差異不明顯(p>0.05)。研究表明真空厭氧處理時間或間歇厭氧處理時間過長,都會對成茶品質造成一定的影響[21]。處理3與處理4相比,由于在2 h的攤放過程中,熱量散失,水汽減少,芽葉紅變現(xiàn)象極少,悶味也有所減輕,但是處理5經過兩次厭氧3 h/有氧2 h間歇處理的時間過長,紅變現(xiàn)象較重,紅梗紅葉較多,悶味較重,嚴重影響了茶葉的品質。

處理3的GABA含量為(2.05±0.12) mg/g,并高于GABA茶的標準[6],因此,在兼顧GABA的含量及茶葉品質的同時,處理3即按照一次真空厭氧間歇(真空厭氧3 h→有氧2 h→真空厭氧3 h)富集GABA的效果最為理想。

2.3 正交實驗結果分析

在厭氧條件下,茶鮮葉中的L-Glu在GAD的催化作用下脫去羧基,生成GABA。因此,將影響GAD酶促反應生成GABA的四個因素A鮮葉嫩度、B真空度、C富集溫度[12-16]、D厭氧時間進行正交優(yōu)化實驗,結果見表2～表4。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

表4 不同真空厭氧間歇富集后茶鮮葉內含物及色澤變化Table 4 GABA content and color change of the tea leaf in different anaerobic condition

由表2中的極差R值的大小和表3的F測驗結果分析可知,真空度B是影響茶葉中GABA含量的主要因素,其次是厭氧時間。鮮葉嫩度和富集溫度的四個水平均沒有明顯的差異性。

不同真空度對茶葉中GABA含量的影響在F0.01(3,3)水平下極為顯著,四個水平中最優(yōu)的水平是真空度為B4,即0.09 MPa。說明采用真空作為厭氧處理條件時,真空度越高,茶葉中GABA的含量也越高,這可能是由于茶鮮葉在絕對厭氧條件下更有利于激發(fā)GAD酶活性,從而促進GAD酶促反應生成GABA。

厭氧處理時間在F0.05(3,3)水平下顯著,四個水平中最優(yōu)的是D2,即真空厭氧3 h→有氧2 h→真空厭氧3 h,之后,隨著厭氧處理時間加長,其GABA的含量卻有所減少,說明在提高茶葉中GABA含量時,并不是厭氧處理的時間越長越好。這可能是由于茶葉中的Glu是具有一定量的,在經過一段時間的酶促反應后,已被完全轉化的緣故。厭氧時間對茶葉品質影響較大,由表4可知,厭氧處理時間過長,不僅會造成較多的紅梗、紅葉,而且還極易產生一種“悶味”。

鮮葉嫩度對茶葉中GABA含量的影響不顯著(p>0.05),其中四個水平中最優(yōu)的水平是B2一芽二葉。從表2中鮮葉嫩度各個水平的平均值來看,用茶鮮葉的一芽二、三葉來富集GABA的含量效果較好,這可能是由于一芽二、三葉的氨基酸含量相對較高,給GAD酶促反應提供了較為充足的反應條件,其機理還有待進一步的研究。富集溫度對茶葉中GABA含量的影響在本實驗中未達到顯著水平,說明厭氧溫度對GABA含量基本無影響。

但是,鮮葉嫩度、厭氧時間和溫度對茶葉品質有一定的影響。由表4可知,不同嫩度的茶鮮葉其氨基酸、茶多酚、咖啡堿的含量也不同,在同一嫩度中,與未經厭氧處理的對照組相比,真空厭氧處理后的茶葉氨基酸總量均略有增加,茶多酚的含量均有不同程度的降低,而咖啡堿的含量變化不明顯。不同嫩度的茶葉處理溫度在4 ℃、15 ℃的條件下,溫度在26 ℃下茶鮮葉富集后的色澤都能保持正常的綠色,而當處理溫度到達37 ℃時,間歇厭氧富集處理一芽二葉鮮葉6 h后就發(fā)生“紅變”,連續(xù)厭氧處理一芽一葉5 h葉片就會變黃。這是因為茶鮮葉中含有大量的多酚氧化酶(最適溫度35 ℃)、過氧化物酶等酶類,采摘下來的茶鮮葉若不及時進行“高溫殺青”滅酶,多酚類物質極易被氧化出現(xiàn)“紅變”現(xiàn)象,造成紅梗、紅葉[22]。所以,表2中厭氧溫度的最優(yōu)水平是C1即溫度4 ℃,但溫度在室溫26 ℃下進行厭氧處理,對GABA的含量影響也不大,綜合考慮到茶葉品質和實際應用時,可以選擇在26 ℃下進行厭氧處理。

3 結論

本文采用一次真空厭氧間歇富集技術對4個不同嫩度的茶鮮葉進行了優(yōu)化,結果發(fā)現(xiàn):采用真空作為厭氧處理條件時,真空度對GABA含量的影響極為顯著,真空度越高,GABA的含量越高。厭氧處理時間對GABA含量影響顯著(p<0.05),在一定范圍內,厭氧處理時間越長,其GABA的含量越高,但超過一定的時間后,GABA的含量不再增加反而減小。鮮葉嫩度、厭氧處理溫度對GABA含量的影響不大,但溫度對茶葉品質影響很大,如厭氧處理溫度在37 ℃,一芽一葉茶鮮葉經過5 h厭氧處理葉片就會變黃。由于夏、秋季溫度較高,所以在對茶鮮葉進行厭氧處理時,應適當降溫。

總之,綜合考慮到GABA及茶葉主要內含物質氨基酸、茶多酚的含量,結果表明采用一芽二葉的鮮葉經真空厭氧間歇處理8 h富集GABA的效果最為理想,即一芽二葉在26 ℃,0.09 MPa條件下,按照先真空厭氧3 h,再有氧2 h,最后真空厭氧3 h的處理方式富集GABA效果最好,含量可達192.79 mg/100 g,氨基酸、茶多酚分別可達4.21%、15.80%。

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