微波輔助酶法優化懷山藥多糖提取工藝的研究

王 珺,李玉偉,江 姜,李桂杰,池浩東,楊占群,徐俊杰,*

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林吉林 132013; 2.吉林醫藥學院臨床醫學院·附屬醫院,吉林吉林132013; 3.吉林醫藥學院基礎醫學院,吉林吉林 132013)

山藥,薯蕷科薯蕷屬植物[1],其活性成分主要有多糖、皂苷、酚類等[2],其中山藥多糖作為一種研究較多的活性成分,具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、抗突變[3-5]等多種功能,進行山藥多糖的產業開發將具有良好的前景,因此進行山藥多糖工藝優化研究,有效提高山藥多糖的提取率具有重要意義。

目前多糖提取方法主要有水浴浸提法、酶法、微波法、超聲輔助法[6]、逐步醇沉法[7]等。常規的浸提法效率低。酶解法可以作用于細胞壁,充分釋放多糖,作用條件相對溫和,提取效率高,但受實驗條件影響較大。微波法原理為熱效應破壁[8],該方法簡便易操作,提取速度快,效率高。應用微波輔助,水浴浸提山藥多糖[9],可提高提取效率。考慮利用微波輔助酶解進行提取可作為一種提取山藥多糖的新思路。

根據已有研究,懷山藥中多糖含量豐富[10],但懷山藥多糖的提取率仍有待提高。本研究以懷山藥為原料,采用微波輔助酶解聯合作用的方法,以多糖提取率為檢測指標,探究浸提溫度、浸提時間、料液比、微波功率對懷山藥多糖提取率的影響。通過正交實驗確定多糖提取的最優條件,Sevage法除蛋白,優化懷山藥多糖的提取工藝,為懷山藥多糖的進一步研究與工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

懷山藥片(懷山藥自然風干制成) 吉林亞泰明星制藥有限公司;α-淀粉酶(40000 U/mg)、纖維素酶(11000 U/mg) 長春錦能生物技術有限公司;蒽酮、葡萄糖標準品 國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍 中科院新疆化學所生化試劑廠;牛血清蛋白 BBI;氫氧化鈉、鹽酸、氯仿、正丁醇、硫酸、無水乙醇 皆為國產分析純試劑。

HH-601型超級恒溫水浴鍋 金壇市華峰儀器有限公司;PH05型電熱恒溫干燥箱 上海實驗儀器廠;721型可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;FA1104N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;PJ23C-SC1美的微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司;JYL-C020型九陽豆漿機 九陽股份有限公司;TDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥多糖的提取 取懷山藥片,利用豆漿機粉碎制成懷山藥粉,精確稱取5.0 g干燥山藥粉末,加入適量蒸餾水,調節溶液至最適pH,加入0.05 g淀粉酶和0.005 g纖維素酶[8-12],55 ℃熱水浴酶解1 h,期間玻璃棒緩慢手動攪拌。取出后于微波爐中進行微波輻射處理1 min[13],之后在熱水浴中浸提,再次手動攪拌。浸提完成后,靜置冷卻離心(3000 r/min,15 min)收集上清液。按照上清液∶無水乙醇=1∶4的體積比,在冷卻后的上清液中加入無水乙醇,充分混合后靜置過夜,得山藥粗多糖。用Sevage試劑洗滌3次,并用考馬斯亮藍法檢測蛋白質含量,烘干后得到白色粉末狀多糖。

1.2.2 標準曲線的繪制及多糖含量的測定 精密稱取葡萄糖標準品0.1023 g于1000 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度(100 mg/L),搖勻,備用。分別吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于試管中,分別加入蒸餾水至體積為1.0 mL,空白管加入1.0 mL蒸餾水做對照,各管中加入4.0 mL蒽酮試劑,迅速浸于冰水浴中冷卻,后搖勻置沸水浴加熱10 min,取出置冷卻至室溫,在紫外分光光度計波長620 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度(ug/mL)為橫坐標,吸光度為橫坐標繪制標準曲線。得到標準曲線y=0.0012x+0.0049(y為吸光度,x為葡萄糖濃度,mg/mL),R2=0.9998。多糖含量測定:精密稱取山藥粗多糖0.1037 g加蒸餾水溶于1000 mL量瓶中,精確吸取1 mL置于試管內,按照蒽酮-硫酸法處理后于620 nm處測定其吸光度,代入葡萄糖標準曲線得山藥多糖樣品含量。多糖提取率計算公式為:

多糖提取率(%)=G1/G2×100

式中:G1為提取的山藥多糖質量,g;G2為山藥粉質量,g。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 浸提溫度對懷山藥多糖提取率的影響 固定料液比為1∶5,浸提時間為3 h,浸提2次,微波功率為750 W,探究不同浸提溫度(75、80、85、90、95 ℃)對懷山藥多糖提取率的影響。

1.2.3.2 浸提時間對懷山藥多糖提取率的影響 固定料液比為1∶5,浸提溫度為85℃,浸提2次,微波功率為750 W,探究不同浸提時間(1、2、3、4、5 h)對懷山藥多糖提取率的影響。

1.2.3.3 料液比對懷山藥多糖提取率的影響 固定浸提溫度為85 ℃,浸提時間為3 h,浸提2次,微波功率為750 W,探究不同料液比(1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5、1∶6.0、1∶6.5 g/mL)對懷山藥多糖提取率的影響。

1.2.3.4 微波功率對懷山藥多糖提取率的影響 固定料液比為1∶5,浸提時間為3 h,浸提2次,根據文獻[14-15],微波功率過高,多糖提取率下降,故選取不同微波功率(600、675、750、825、900 W),探究其對懷山藥多糖提取率的影響。

1.3 正交實驗

在單因素實驗的基礎上選取浸提溫度(A)、浸提時間(B)、料液比(C)和微波功率(D)4個因素,設置3個水平,以多糖提取率為考察指標,設計L9(34)正交實驗優化山藥多糖提取工藝。因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.4 數據統計分析

應用SPSS 20.0軟件分析單因素實驗數據的顯著性差異。采用單因素方差分析進行各水平間差異的比較,LSD-t檢驗進行兩兩比較。結果以Mean±SD表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提溫度對懷山藥多糖提取率的影響 由圖1可看出,當溫度在75～80 ℃時,多糖的提取率隨著浸提溫度的增高而略有升高,溫度在80～85 ℃范圍內,多糖提取率隨溫度上升略有下降,通過對二者兩兩比較分析得p>0.05,故在此范圍內,多糖提取率無顯著性差異。當溫度達到85～95 ℃范圍內,多糖提取率隨溫度上升而顯著升高,原因可能是，由于溫度升高,多糖溶解度和擴散率升高,使提取率不斷升高,在95 ℃時多糖提取率達到27.04%。基于文獻與前期實驗[16-17],選取85、90、95 ℃三個水平進行正交實驗。

圖1 提取溫度對山藥多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the polysaccharide yield注：字母不同表示有顯著差異(p<0.05),圖2～圖4同。

2.1.2 浸提時間對懷山藥多糖提取率的影響 由圖2可看出,浸提時間在1～3 h范圍內,多糖的提取率隨著浸提時間的延長而升高,浸提時間在3～4 h范圍內,多糖提取率隨浸提時間的延長而略有下降,浸提時間在4～5 h范圍內,多糖提取率呈上升趨勢,可能是由于時間過長,多糖的結構遭到破壞,導致多糖提取率下降[17-18]。結果表明,3 h時多糖提取率最高,達27.4%,選取2、3、4 h三個水平進行正交實驗。

圖2 浸提時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on the polysaccharide yield

2.1.3 料液比對懷山藥多糖提取率的影響 由圖3可看出,當料液比在1∶4.5～1∶5.0范圍內,多糖的提取率隨料液比增大而顯著升高,當料液比在1∶5～1∶6.5范圍內,多糖的提取率隨料液比增大而下降,原因可能是由于水量增加,溶解的雜質增多,影響多糖的提取[19]。當料液比為1∶5時,多糖提取率達到33.67%,選取1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5三個水平進行正交實驗。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on the polysaccharide yield

2.1.4 微波功率對懷山藥多糖提取率的影響 由圖4可看出,懷山藥多糖的提取率隨微波功率的升高而顯著提高。王安良等采用微波輔助法得到多糖提取率為13%[20-21],而本實驗在微波功率900 W條件下,得多糖提取率為33.03%,提取率有顯著提高,原因可能由于微波功率升高,熱效應導致細胞破裂多糖釋放,進而進行水浴浸提,多糖充分溶解提取率升高,但溫度過高,多糖降解。選取750、825、900 W三個水平進行正交實驗。

圖4 微波功率對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the polysaccharide yield

2.2 正交實驗

根據單因素實驗結果,確定微波輔助提取山藥多糖的最佳條件,實驗結果見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2得：各因素對多糖產率的影響為：RC>RD>RA>RB,即料液比>微波功率>浸提溫度>浸提時間,山藥多糖的最佳提取條件為A1B3C3D2，即提取溫度為85 ℃,提取時間為4 h,料液比1∶5.5 (g/mL),微波功率為825 W,此時山藥多糖的產率為34.78%±1.19%。

3 結論與討論

多糖是一種結構復雜用途廣泛的物質,可從各種動植物、真菌等物質中提取。提取懷山藥多糖的方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超聲提取法、微波提取法、超高壓提取法、膜分離法等[7]。傳統的水浴浸提法提取率3.37%[8],微波法為8.35%[14],纖維素酶酶解法山藥多糖提取率8%[23],α-淀粉酶酶解法為11.5%[24],酶解法優勢在于作用條件溫和,保持物質原有活性,微波法具有提取效率高、提取速度快、易操作等優點。本研究考慮綜合酶法和微波法的優點,運用微波輔助法通過熱效應,使懷山藥溶液內部溫度升高,加入α-淀粉酶與纖維素酶,可以溶解懷山藥表面淀粉顆粒,分解細胞壁,促進懷山藥多糖的釋出。通過單因素分析及正交實驗,建立并優化了微波輔助與酶解聯合作用提取懷山藥多糖的工藝,確定最佳提取條件為溫度85 ℃,提取時間4 h,料液比1∶5.5 (g/mL),微波功率為825 W,在此條件下懷山藥多糖的提取率可達34.78%±1.19%,與傳統的水浴浸提法[22]及單純的酶法[23]、微波輔助法[14]相比,本實驗提取率有顯著提高。此外,根據王莉[25]等在微波輔助提取米糠多糖及張玲玲、趙希艷[25-26]等在研究中進行驗證實驗,確定了微波輔助與酶解法提取懷山藥多糖不改變其理化性質。本實驗為懷山藥多糖提取工藝優化提供了依據,也為后續研究懷山藥多糖的理化性質打下堅實基礎。

研究表明,山藥多糖有增強免疫力、降血糖降血脂等功效[7],有良好的開發前景。山藥作為高糖、無脂肪的天然保健品,在我國的種植開發極為廣泛,但山藥的開發利用還僅限于制作復合飲料或山藥飲片、山藥粉的初級階段,而未能高效利用山藥多糖的優質作用。本研究立足于山藥多糖開發的巨大潛力,為后續山藥多糖的活性研究及產業化開發奠定基礎。

[1]聶凌鴻,寧正祥. 廣東淮山多糖的純化及化學結構鑒定研究[J].林產化學與工業,2004,24(S1):101-106.

[2]謝興源.山藥的主要成分及其應用價值[J].現代農業科技,2009(6):76-77.

[3]Hao Hao LX,Zhao XH. Report-Invitroimmune potentials of a water-soluble polysaccharide extract from Dioscorea opposita planted in Henan Province,China[J]. Pak J Pharm Sci,2017,30(4):1383-1388.

[4]孫鋒. 鮮山藥的生物活性研究[D].無錫:江南大學,2005.

[5]Zhang Z,Wang X,Liu C,et al.The degradation,antioxidant and antimutagenic activity of the mucilage polysaccharide from Dioscorea opposita[J]. Carbohydr Polym,2016,150:227-231.

[6]Zhang L,Wang M. Optimization of deep eutectic solvent-based ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Dioscorea opposita Thunb[J]. Int J Biol Macromol,2017,95:675-681.

[7]Li Q,Li W,Gao Q. Hypoglycemic Effect of Chinese Yam(Dioscorea opposita rhizoma)Polysaccharide in Different Structure and Molecular Weight[J]. Food Sci,2017,82(10):2487-2494.

[8]王洪新,王遠輝. 山藥多糖研究進展[J]. 食品與生物技術學報,2011,30(3):321-327.

[9]王娜,潘治利,孫曉瑞,等.鐵棍山藥水溶性粗多糖提取工藝的研究[J]. 江西農業報,2010,22(12):106-109.

[10]Li J J,Ren M L,Wang J,et al. Research on Breeding ofDioscoreaoppositacv. Tiegun[J]. Zhong Yao Cai,2015,38(9):1787-1791.

[11]李培. 纖維素酶酶解法提取懷山藥多糖工藝研究[J]. 蚌埠學院學報,2015,4(6):13-16.

[12]董義,沈才洪,曾里,等. 酶解輔助提取山藥多糖的研究[J]. 河南工業大學學報:自然科學版,2015,36(3):56-60.

[13]王安良,云霞,楊紅. 響應曲面法優化山藥中多糖的微波提取工藝[J]. 食品科技,2007(12):86-90.

[14]李建剛,李慶典. 微波提取山藥多糖的研究[J]. 中國釀造,2012,31(10):103-105.

[15]王濤,朱曉偉,邵果園,等. 正交設計法優選紫山藥多糖的提取工藝[J]. 安徽農業科學,2015,43(34):62-64.

[16]王媛媛,許蘭淑,樊瑋,等. 山藥多糖提取率-活性綜合優化提取工藝[J]. 食品安全質量檢測學報,2015,6(6):1980-1986.

[17]吉仙枝. 超聲波協同α-淀粉酶提取野生山藥多糖工藝研究[J]. 三門峽職業技術學院學報,2015(1):140-144.

[18]成娟. 山藥多糖提取工藝及質量控制研究[D].成都:西南交通大學,2014.

[19]龍菊,孫翠英,張紅霞,等. 正交設計與響應面法優化山藥多糖提取工藝[J]. 食品研究與開發,2017,38(4):54-58.

[20]王安良,云霞,楊紅. 響應曲面法優化山藥中多糖的微波提取工藝[J]. 食品科技,2007(12):86-90.

[21]秦婷,郭金甲,劉井利,等. 山藥多糖的研究進展[J]. 中國當代醫藥,2013,20(13):20-21,25.

[22]董汝晶. 多糖提取方法的研究進展[J]. 農產品加工.學刊,2014(8):46-48,51.

[23]張俊婷. 山藥多糖提取工藝優化及其抗菌活性研究[D]. 佳木斯:佳木斯大學,2014.

[24]王莉,陳正行,張瀟艷. 微波輔助提取米糠多糖的工藝[J]. 江蘇大學學報:自然科學版,2007,28(3):193-196.

[25]張玲玲,黃兮,邱紹兵,等. 微波輔助提取桑葚多糖的工藝研究[J]. 山東化工,2012,41(12):9-12,15.

[26]趙希艷,賈凌杉,馬華. 微波輔助提取黑木耳多糖的工藝[J]. 河北科技師范學院學報,2012(1):65-67,71.