薏米中β-谷甾醇的分離純化及其抗氧化活性的研究

張冬陽,郭雪松

(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

薏米(CoixchinensisTod.)又稱薏苡仁、薏仁米等,是常見的一種谷物[1],具有清熱、消痛、祛濕、健脾補肺之功效,常作為藥用[2],也是滋補、保健和潤膚的佳品[3]。薏米中不僅含有豐富的蛋白質、碳水化合物以及各種微量元素,還含有較多的β-谷甾醇,使其具有抗氧化、抗菌消炎、降低膽固醇、調節脂代謝、抗腫瘤等功效[4-6]。

米制品中有關β-谷甾醇的分離純化及抗氧化作用的研究文獻報道較少,洪慶慈等人從燕麥中提取燕麥油,再從中提取β-谷甾醇放入色拉油中,結果表明β-谷甾醇具有一定的抗氧化作用[7]。烏汗其木格從裸燕麥麩皮中提取β-谷甾醇,將其放在油脂中進行抗氧化測定,結果表明,時間越久,抗氧化作用越強;濃度越大,抗氧化作用越大[8]。因此對于深入了解薏米中β-谷甾醇的抗氧化能力,提高薏米的營養價值,具有重要意義。

β-谷甾醇具有很好的抗氧化活性,然而從米制品中提取β-谷甾醇并進行抗氧化性的研究尚未見相關報道。本實驗利用大孔樹脂分離純化薏米中β-谷甾醇的粗提液,通過響應面優化,得到最佳純化工藝,以提高β-谷甾醇的提取得率、回收率和純度，為了深入了解β-谷甾醇的生物活性,并進一步研究其抗氧化作用,為天然抗氧化劑的開發提供參考依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薏米 購自錦州市新瑪特超市,粉碎過60目篩;β-谷甾醇標準品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,鄭州鑫瑞化驗設備科技銷售公司;AB-8、D-101、DA-201樹脂 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2苦苯肼 北京索萊寶科技有限公司;鄰二氮菲 北京索萊寶科技有限公司;VC、水楊酸、雙氧水、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、DPPH等其他試劑 均為分析純,購自天津貝斯醫藥科技有限公司。

高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;FA2004N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀 島津企業管理(中國)有限公司;旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提液的制備 參照張冬陽的方法進行提取[12]。

1.2.2β-谷甾醇分離純化流程 取β-谷甾醇粗提液100 mL→-80 ℃冷凍干燥成粉末→取β-谷甾醇粗品10 g→加175 mL 95%乙醇溶解→過濾→濾液水洗至中性→大孔樹脂吸附分離→旋轉蒸發回收溶劑→β-谷甾醇純化樣品[9,13]

1.2.3 大孔樹脂的靜態吸附與解析

1.2.3.1 大孔樹脂預處理 稱取適量的大孔樹脂,用95%的乙醇浸泡24 h,取出大孔樹脂,用蒸餾水洗至無醇味,用5%的HCl浸泡3 h,用水洗至中性,再用5% NaOH浸泡3 h,水洗至中性[14-16]。

1.2.3.2 大孔樹脂的篩選 準確稱取經處理后的AB-8、D-101、DA-201三種大孔樹脂各5 g于250 mL錐形瓶中,分別加入40 mL的β-谷甾醇粗提液(濃度0.5 mg/mL),于25 ℃,100 r/min的條件下充分振蕩吸附24 h,過濾,測定濃度;在過濾后的樹脂中加入100 mL水,于25 ℃的條件下恒溫振蕩3 h(100 r/min),過濾,用濾紙吸干樹脂,加入100 mL 95%的乙醇,于相同條件下洗脫24 h,過濾,測定濃度。參照以下公式計算吸附率(Q1)及解析率(Q2)以及回收率,并以吸附率、解析率為指標選擇最佳的大孔樹脂[14,17-18]。

式中:C0-供試液濃度(mg/mL);C1-吸附平衡后濃度(mg/mL);C2-解析液濃度(mg/mL);V1-吸附液體積(mL);V2-解析液體積(mL);m-樹脂質量(g)。

1.2.4 薏米中β-谷甾醇純化的單因素實驗設計

1.2.4.1 樹脂質量對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 分別稱取1、2、3、4、5 g 處理后的AB-8大孔樹脂,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度進行動態吸附,測量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計算吸附率、回收率。

1.2.4.2 進樣濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份處理后的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,然后分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度用75%的乙醇進行洗脫,測量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計算吸附率、回收率。

1.2.4.3 洗脫劑濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份處理后的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度進行動態吸附,分別用15%、35%、55%、75%、95%的乙醇進行洗脫,測量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計算吸附率、回收率。

1.2.4.4 洗脫速度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份預處理的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,用75%的乙醇進行動態洗脫,設置洗脫速度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 mL/min,測量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計算吸附率、回收率。

1.2.5 響應面實驗設計 結合單因素實驗結果,選擇影響樹脂質量、進樣濃度、洗脫速度,采用三因素三水平的響應面分析法,對薏米中β-谷甾醇純化工藝進行優化,各因素的水平見表1。

表1 Box-Behnken設計實驗因素與水平Table 1 Box-Behnken design experiment factors and levels

AB-8大孔樹脂純化效果的測定 純度對比:取上柱前的粗提液和經樹脂洗脫后的溶液各50 mL,分別進行旋轉蒸發并冷凍干燥,各取5 g等質量凍干樣品,通過液相色譜測β-谷甾醇的純度[19],具體條件為:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-乙腈(35∶65)、波長:246 nm、柱溫:30 ℃、進樣量:10 μL、流速:0.8 mL/min。

按以下公式計算純度:

式中,m1-粗提液凍干后凍干物的含量mg;m2-洗脫液冷凍干燥后凍干物質量mg。

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.7.1β-谷甾醇對DPPH·清除能力 分別取濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL純化后的樣品溶液2 mL,各加入2 mL的DPPH,參照劉海霞[21]等人的方法。在25 ℃水浴中放置30 min,用95%的乙醇作空白對照,在517 nm處測得吸光度為A0,樣品的吸光度為A1。同時以VC作為對照,測不同濃度的吸光度。

式中:A1是2 mL DPPH加2 mLβ-谷甾醇溶液測得的吸光度;A2是2 mLβ-谷甾醇溶液加2 mL 95%乙醇測得的吸光度;A0是2 mL DPPH加2 mL 95%乙醇測得的吸光度。

1.2.7.2β-谷甾醇對·OH清除能力的研究 參照田瑤[20-21]等人的方法,采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法進行測定。取10 mL試管,依次加入1 mL FeSO4溶液,1 mL 8.8 mmol/L的雙氧水溶液,1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,混勻,于36～37 ℃水浴中反應15 min,在波長510 nm處測吸光度A0。按上述條件,分別加入1 mL不同濃度的β-谷甾醇標準溶液,于36～37 ℃水浴中反應15 min,在波長510 nm處測吸光度Ax。

其中:A0是空白對照測得的吸光度;Ax是加入β-谷甾醇溶液測得的吸光度。

1.3 數據處理

實驗平行數3次,結果采用平均值±標準差形式表示,單因素實驗采用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進行數據處理。響應面實驗采用Design Expert 8.0.6進行實驗數據處理。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂吸附效果的比較

由圖1可知,AB-8大孔樹脂的吸附率和解析率高于其他兩種樹脂,所以選擇AB-8樹脂作為薏米中β-谷甾醇分離純化的最佳樹脂。

圖1 大孔樹脂吸附效果的比較Fig.1 Comparison of adsorption effect of macroporous resin

2.2 單因素實驗

2.2.1 樹脂質量對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖2可知,隨著樹脂質量的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率先增加后下降,回收率隨著吸附率的增加而變大后趨于穩定。當樹脂質量為3 g時,β-谷甾醇的吸附率和回收率有最大值。當樹脂取1～2 g時,由于樹脂質量太少,樹脂的吸附能力有限,吸附β-谷甾醇的量偏少,從而導致吸附率和回收率都低[22-23]。當樹脂質量大于3 g時,由于樹脂達到吸附平衡,吸附率呈下降趨勢,而回收率趨于穩定。所以最佳樹脂質量為3 g。

圖2 樹脂質量對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.2 Effect of resin mass on the purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.2 進樣濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖3可知,上樣濃度從0.1 mg/mL增加到0.3 mg/mL時,吸附率和回收率都呈逐漸上升的趨勢。當上樣濃度為0.5 mg/mL時,薏米中β-谷甾醇的吸附率和回收率均達到最大值。不斷增大上樣濃度,當濃度大于0.5 mg/mL時,吸附率趨于穩定,而回收率不斷下降,這是由于進樣濃度大于樹脂的吸附飽和度。當濃度過高時,樹脂的再生次數增加,樹脂使用周期縮短[17,24]。因此最佳上樣濃度為0.5 mg/mL。

圖3 進樣濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.3 Effect of injection concentration on the purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.3 洗脫劑濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖4可知,隨著洗脫劑濃度的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率和回收率呈先上升后趨于平緩的趨勢。當洗脫劑濃度為15%～75%時,β-谷甾醇的吸附率和回收率逐漸變大,當洗脫劑濃度為95%時,兩者變化趨于穩定,因為乙醇濃度太高時,大部分雜質也會被洗脫出來[17,25-26],也為了節約成本,因此選擇濃度為75%的乙醇進行洗脫。

圖4 洗脫劑濃度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.4 Effect of eluent concentration on purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.4 洗脫速度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖5可知,隨著洗脫速度的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率、回收率都在下降,當洗脫速度為1 mL/min時,吸附率和回收率有最大值,當洗脫速度大于1 mL/min時,兩者下降速度較為明顯。由于洗脫速度過低,吸附在樹脂內部的β-谷甾醇不能被充分洗脫,而當洗脫速度過快時,有部分β-谷甾醇不能被洗脫出來,使吸附率降低,從而導致回收率降低[26-27]。因此。最佳的洗脫速度為1 mL/min。

圖5 洗脫速度對薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.5 Effect of elution rate on purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 實驗設計及結果 根據單因素實驗結果,選擇樹脂質量、進樣濃度、洗脫速度為考察因素,以β-谷甾醇回收率為響應值進行優化,得到的響應面實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert軟件對實驗數據進行回歸分析,得到回歸模型的方程為:Y=85.08+3.73A+3.05 B+1.63C-3.02AB+1.87AC-0.31BC-7.13A2-4.09B2-2.65C2。

由方差分析可知,模型p<0.0001,說明此回歸方程差異極顯著,失擬項p=0.1547>0.05,差異不顯著。說明該方程與實際情況吻合較好,實驗誤差小。該回歸方程的擬合度是97.41%(R2=0.9741),說明實際值與預測值擬合較好,實驗方法可行。一次項A、B對回收率的影響極顯著(p<0.01),C對回收率影響顯著(p<0.05)。交互項AB、AC對回收率影響顯著(p<0.05),而BC對回收率影響不顯著(p>0.05)。二次項A2、B2、C2對回收率的影響都極顯著(p<0.01)。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVE of regression analysis

2.3.3 回收率的響應曲面分析 由圖6可知,隨著進樣濃度和樹脂質量的增加,回收率先逐漸上升然后平緩下降,響應值具有最大值。這是因為有效成分擴散到樹脂中達到飽和時,增加上樣濃度,會使有效成分發生泄漏,從而使回收率降低[27]。圖的坡度越陡,等高線形狀為橢圓形,表示樹脂質量和進樣濃度這兩個因素交互作用顯著[14]。

圖6 樹脂質量與進樣濃度交互作用圖Fig.6 Interaction between resin mass and injection concentration

由圖7可知,回收率隨著樹脂質量的增加先上升后下降,不斷加大洗脫速度,回收率增加的趨勢較為平緩,因為樹脂的量不夠時,β-谷甾醇不能被完全洗脫出來,當樹脂的量過多時,大部分雜質會隨之洗脫下來,所以回收率會降低[27-28]。且圖中等高線的形狀為橢圓形,說明兩因素之間的交互作用顯著[14]。

圖7 樹脂質量與洗脫速度交互作用圖Fig.7 Interaction between resin quality and elution rate

由圖8可知,隨著進樣濃度和洗脫速度的增加,回收率上升的趨勢緩慢,且等高線為圓形,說明這兩個因素之間交互作用不顯著。

圖8 進樣濃度與洗脫速度交互作用圖Fig.8 Interaction between sample concentration and elution speed

2.3.4 驗證實驗 應用軟件分析,得到最佳工藝參數為:樹脂質量3.26 g,進樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1.19 mL/min，此條件下得到β-谷甾醇回收率的模型預測值為86.2707%。考慮到實際操作,將其修正為:樹脂質量3 g,進樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1 mL/min。為了驗證預測值的可靠性,在此條件下進行3次平行實驗,得到β-谷甾醇回收率的平均值分別為85.35%、84.34%、85.77%,平均回收率為85.56%,與預測值86.2707%比較接近,說明該模型回歸方程具有可靠性,可以應用于β-谷甾醇純化工藝的研究。

2.4 AB-8大孔樹脂純化效果的測定

由圖9可知,β-谷甾醇經AB-8大孔樹脂純化后,樣品的純度由原來的13.8%提高到76.17%。表明實驗精密度較好,工藝條件穩定便于控制[28],AB-8樹脂對β-谷甾醇的純化具有顯著效果。

圖9 純化前后樣品純度的對比Fig.9 Comparison of purity of samples before and after purification

2.5 抗氧化活性的比較

2.5.1β-谷甾醇對DPPH·清除能力 由圖10可知,薏米中的β-谷甾醇對DPPH具有清除能力,且純化后的樣品對DPPH自由基的清除能力高于VC和純化前的樣品。當濃度為0.1 mg/mL時,VC對DPPH自由基的清除能力最高,當濃度為0.4 mg/mL時,三種溶液對DPPH自由基的清除能力幾乎相同,隨著濃度不斷增大,對DPPH自由基的清除能力都呈不斷上升的趨勢,且經過AB-8樹脂純化后的樣品對DPPH自由基的清除能力有顯著提高[28-29]。

圖10 純化前后的樣品與VC對DPPH清除能力的對比Fig.10 Comparison of DPPH scavenging ability of samples before and after purification with VC

2.5.2β-谷甾醇對·OH清除能力的研究 由圖11可知,β-谷甾醇對于·OH具有一定的清除能力,純化后的樣品清除率最大,高于VC溶液和純化前的樣品。當濃度在0.05～0.1 mg/mL范圍內,VC溶液和純化前的樣品對·OH的清除能力平緩上升;當濃度大于0.2 mg/mL時,兩種樣品的·OH清除率直線上升,后趨于穩定。濃度為0.05～0.2 mg/mL時,純化后樣品的清除能力上升幅度較大;當濃度大于0.2 mg/mL時,呈緩慢上升趨勢。由此可見,濃度越高,純度越好的樣品對·OH的清除能力也越大[25,30-31]。

圖11 純化前后的樣品與VC對·OH清除能力的對比Fig.11 Comparison of the scavenging ability of ·OH from samples before and after purification

3 結論

本實驗通過比較三種樹脂的吸附和解析力,將AB-8樹脂作為分離純化最佳的樹脂。在單因素的基礎上,對樹脂質量、進樣濃度、洗脫速度三個因素進行響應面分析,得到最佳工藝條件為:樹脂質量3 g,進樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1 mL/min,此條件下得到β-谷甾醇回收率的平均值為85.56%±0.33%,與預測值86.2707%比較接近,β-谷甾醇的純度由原來的13.8%提高到76.17%。將純化前后的樣品做抗氧化研究,表明純度越高,抗氧化能力越大。

[1]楊梓晨,梁婧,劉雨晴,等. 薏米的成分分析[J]. 安徽農業科學,2011,39(2):756,758.

[2]金黎明,劉垠孜,趙曉蕾,等. 薏苡仁有效成分研究進展[J]. 安徽農業科學,2011,39(10):5734,5750.

[3]Bin Sayeed,Muhammad Shahdaat,Syeda Sadia Ameen. Beta-sitosterol:A promising but orphan nutraceutical to
Fight against cancer[J]. Nutrition and Cancer,2015,67(8):1216-1222.

[4]黃瀅璋,趙雁武,周振中. 植物甾醇清除自由基活性研究[J]. 糧食科技與經濟,2012,37(4):40-41,45.

[5]Awad,AB. Peanuts as a source of beta-sitosterol,a sterol with anticancer properties[J]. Nutrition and Cancer. United States,2000,36(2):238-241.

[6]李丹平. 紅黑二丸中甾醇類物質提取、鑒定及生理活性的研究[D].武漢:華中農業大學,2011

[7]洪慶慈,王梅,姜偉,等.燕麥中主要甾醇的鑒定和效能實驗[J].食品科學,2002(1):103-106.

[8]烏漢其木格. 裸燕麥麩皮中β-谷甾醇的分離提取及其特性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學,2007.

[9]季慧,陳斌斌,黃越燕.大孔吸附樹脂分離純化生物堿類化合物研究進展[J].亞太傳統醫藥,2017,13(1):72-75.

[10]Njinga,Ns. Isolation and antimicrobial activity ofβ-Sitosterol-3-O Glucoside from Lannea Kerstingii Engl. & K. Krause(Anacardiacea)[J]. Nitte University Journal of Health Science,2016,6(1):4-8.

[11]張冬陽,郭雪松.響應面法優化薏米中β-谷甾醇的提取工藝[J].食品工業科技,2017,38(22):206-209,241.

[12]萬建春. 大豆脫臭餾出物中生育酚及甾醇單體的分離純化[D].武漢：武漢工業學院,2008.

[13]葉松華,馮夏珍,王曉燕,等. Box-behnken設計優化黃刺玫果總黃酮純化工藝研究[J/OL].中國食品添加劑,2017(10):73-79.

[14]張俊,李進,呂海英,等. 響應面法優化扁桃果皮熊果酸的純化工藝[J/OL]. 食品與發酵工業,2017,43(10):170-176.

[15]Bhatlum,Singhs,Vermaa. Recovery of naringin from kinnow(Citrus reticulata Blanco)peels by adsorption-desorption technique using an indigenous resin[J]. Sadhana,2017,42(1):85-94.

[16]Lei Z,Xu Wang,Xiao lei Zhang,et al. Purification and identification of anti-inflammatory peptides derived from simulated gastrointestinal digests of velvet antler protein(Cervus elaphus Linnaeus)[J]. Journal of Food & Drug Analysis,2016,24(2):376-384.

[17]陳建中,葛水蓮,昝立峰,等. 響應面優化大孔吸附樹脂分離純化茼蒿總黃酮[J]. 食品與發酵工業,2015,41(11):115-120.

[18]薛雪,孟憲軍,李斌,等. AB-8大孔樹脂分離純化北五味子藤莖總木脂素的研究[J]. 食品與機械,2011,27(1):22-25.

[19]鄧夢琴,林曉瑛,張明,等. 大孔樹脂分離純化菠蘿蜜果皮黃酮工藝及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業科技,2017,38(5):246-251,257.

[20]田瑤. 藍莓中黃酮類物質的提取、分離純化及生物活性研究[D].哈爾濱：東北農業大學,2012.

[21]劉海霞. 蘋果籽油甾醇的分離、提取及其功能性評價[D].西安：陜西師范大學,2009.

[22]吳海成. 玉米須甾醇的提取純化及抑菌活性[D].長春:吉林大學,2013.

[23]Fenglai L,Wei Huan,Wang Lei,et al. Separation and Purification of Macranthoidin B and Dipsacoside B from Flos Lonicerae by HP-20 and HP-SS Macroporous Resin[J]. Agricultural Science & Technology,2016,17(4):765-768.

[24]鐘方麗,金龍哲,王曉林,等. 大孔吸附樹脂純化黃芪莖總黃酮的工藝及其抗氧化性[J]. 河南工業大學學報:自然科學版,2017,38(2):88-94.

[25]鄒家麗. 山茶花(Camelliajaponica)花卉中多酚的提取、純化及抗氧化活性研究[D].重慶:重慶師范大學,2013.

[26]李潔. 大孔吸附樹脂在天然產物分離純化中的應用研究[D].蘭州:蘭州理工大學,2011.

[27]張琳,趙鳳平,江敏瑜,等. Box-Behnken響應面法優選大孔樹脂分離純化三七總皂苷的工藝研究[J]. 成都中醫藥大學學報,2017,40(3):57-61,127.

[28]鄧夢琴. 菠蘿蜜果皮總黃酮的提取、分離純化、結構鑒定及其抗氧化活性研究[D].廣州:華南農業大學,2016.

[29]Emad M,Azza A. Matloub,Mona E. Aboutabl,etal. Assessment of anti-inflammatory,antinociceptive,immunomodulatory,and antioxidant activities ofCajanuscajanL[J]. seeds cultivated in Egypt and its phytochemical composition. Pharmaceutical Biology,2016,54(8):1380-1391.

[30]Havyarimana L,et al. Chemical constituents of millettia barteri and their antimicrobial and antioxidant activities[J].Pharmaceutical biology. England,2012,50(2):141-146.

[31]Raviraj Anand Devkar,Shilpee Chaudhary,Sahithi Adepu,et al. Evaluation of antiurolithiatic and antioxidant potential of lepidagathis prostrate[J]. A pashanbhed plant.pharmaceutical biology,2016,54(7):1237-1245.

歡迎訂閱《食品工業科技》