不同品種石榴果實揮發成分的SPME-GC-MS分析

金 婷,孫 欣,譚勝兵,李卓瓦,馮曉慧,王明林,*

(1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院,山東棗莊 277000; 2.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271000)

石榴(PunicagranatumL.)又名安石榴、丹若、金罌,為石榴科(Punicacae)石榴屬(PunicaL.)落葉灌木或小喬木[1],是一種深受人民喜愛的水果。山東棗莊是我國的石榴產區[2],栽培面積1 萬hm2,年產石榴5萬t,石榴品種達40種以上,所產石榴酸甜可口,除可生食外也可以加工成多種產品[3-6]。石榴本身屬于低芳香性水果[7],因此對石榴揮發成分的測定相對較為困難。國內對其研究主要集中于石榴加工產品的研發和其各種有效成分如總酚物質的抗氧化活性[8-9]上,揮發成分研究略顯不足[10]。隨著石榴加工產品的增多,人們對其品質要求越來越高,而石榴果實中香氣物質的種類和含量是構成及影響其風味品質的重要因素之一。國外研究則多集中于對石榴本身和其加工產品的香氣成分研究上,如Melgarejo等[7]對9個石榴品種的揮發性成分進行了測定和感官鑒評,共檢測出21種芳香成分。Beaulieu等[11]采用固相微萃取法從石榴中吸附香氣成分并采用GC-MS進行測定。

固相微萃取技術是當前國內外廣泛使用的一種富集揮發成分的方法。由于其靈敏度高、無溶劑、吸附性強,且能與氣質分析技術進行聯用等特點，已成為一種用于分析揮發成分的主流方法[12-15]。

本文以山東棗莊四種主產石榴為研究對象,采用固相微萃取進行樣品香氣成分的提取富集并優化萃取條件,確定不同品種石榴果實的香氣成分,采用雙向聚類分析進行分類與比較,為石榴果實特征香氣研究及產品質量控制,提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大馬牙、冰糖籽、大青皮甜、大紅皮甜 山東棗莊驛城萬畝石榴果園中最有代表性的四個石榴主產品種，隨機選擇成熟果實各10顆,冷藏4 ℃保存。

75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB三種型號固相微萃取頭及萃取手柄、頂空進樣瓶 美國Supelco公司;TQ8030三重四極桿氣質聯用儀 日本島津公司;水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將石榴果粒從果實中小心取出,保持石榴果實完整無損壞,選取大小均一的石榴顆粒5顆放入頂空瓶中密封,水浴加熱至一定溫度后,將固相微萃取頭插入頂空瓶內石榴果粒上方,小心推出纖維頭,萃取一定時間后,在進樣口解析,待進樣分析。

1.2.2 固相微萃取條件篩選 以色譜分離所得到的峰個數和峰面積為主要考察指標,對萃取條件進行確定。固定萃取條件為:萃取溫度30 ℃、萃取時間30 min、解析3 min,考察不同規格萃取頭(75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB)對萃取效果的影響。固定萃取條件為:65 μm PDMS/DVB型號萃取頭、萃取溫度30 ℃、萃取時間30 min,考察不同解析時間(1、2、3、4、5 min)對萃取效果的影響。固定萃取條件為:65 μm PDMS/DVB型號萃取頭、萃取溫度30 ℃、解析時間3 min,考察不同萃取時間(10、20、30、40、50、60 min)對萃取效果的影響。固定萃取條件為:65 μm PDMS/DVB萃取頭、萃取時間30 min、解析時間3 min,考察不同萃取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對萃取效果的影響。

1.2.3 色譜條件 GC條件:色譜柱:Rtx-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm);載氣:氦氣;進樣口溫度:250 ℃;程序升溫:初始35 ℃;保持3 min;然后以12 ℃/min升溫到60 ℃;再以5 ℃/min升溫至230 ℃并保持5 min;色譜柱流量:1 mL/min;不分流進樣。

MS條件:離子源:電子轟擊離子源;離子源溫度:230 ℃;接口溫度:210 ℃;溶劑延遲時間:1 min;掃描方式:Q3 SCAN;掃描范圍m/z:45～500;電離能量:70 eV;質譜庫:NIST11、NIST11s。

1.2.4 分析方法 按1.2.2設置儀器參數,將吸附樣品后的萃取頭插入GC進樣口,在進樣口250 ℃ 解析平衡后Q3 SCAN掃描,再進行譜圖解析并與質譜庫比對,匹配后確定揮發成分,并采用峰面積法計算各揮發組分的相對含量。本文對四種石榴品種和它們的揮發成分采用離差平方和法進行聚類分析,分析采用PCOrdv5.0軟件,相似性測定采用歐氏距離。

2 結果與分析

2.1 固相微萃取頭的選擇

從圖1可以看出:萃取頭65 μm PDMS/DVB相對于另外兩種萃取頭富集的揮發性物質數量及面積明顯要更多,可能是因為65 μm PDMS/DVB萃取頭既能吸附極性物質也能吸附非極性物質,因此吸附范圍較大[16],在本文中選擇使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭。

圖1 不同萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 Influence of different extraction heads on extraction effect

2.2 解析時間的選擇

從圖2可以看出,隨著解析時間的延長,出峰個數和峰面積先增大后減少,在解析時間為3 min時,石榴果粒中的揮發性物質的出峰個數和峰面積最大,說明在此時樣品已經全部解析。此后峰面積和出峰個數均變小,可能是由于進樣口溫度高,從而使得揮發性物質發生分解,因此出峰個數和峰面積有所下降,故選擇解析時間為3 min。

圖2 解析時間對萃取效果的影響Fig.2 Influence of desorption time on extraction effect

2.3 萃取時間的選擇

由圖3可知,隨著萃取時間的增加,揮發成分的出峰個數和出峰面積均在增加,30 min時均達到最大。30 min后,出峰個數開始逐步下降,峰面積有所反復但總體下降,這是由于在固相微萃取的過程中還存在著吸附-解析的平衡問題,因此,萃取時間過久反而不利于吸附,故選擇萃取時間為30 min。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響Fig.3 Influence of time on extraction effect

2.4 萃取溫度的選擇

從圖4可以看出,隨著萃取溫度的升高,出峰個數和總面積逐漸升高,這是由于高溫有利于揮發性物質在基質中擴散,縮短了平衡時間,但另一方面,萃取頭的吸附是放熱過程,高溫會使分配系數下降,致使樣品吸附量下降[17],因此石榴果粒中的揮發性物質的出峰個數和峰面積稍有下降,故選擇萃取溫度為60℃。

圖4 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4 Influence of temperature on extraction effect

2.5 不同品種石榴果實揮發性物質成分分析

選用65 μm PDMS/DVB萃取頭,在解析時間3 min,萃取溫度60 ℃,萃取時間為30 min 的條件下對石榴果實的揮發性成分進行分離與鑒定。揮發成分見表1。

表1 石榴果實揮發性成分類別及相對含量Table 1 Aromatic compounds and their relative contents in the fruit of Punica granatum L.

續表

續表

由表1可知,在四種品種石榴中共確定出68種揮發性成分,主要包括28種烯類、13種酯類、13種醇類、6種醛類、2種酮類、1種酸類。其中大馬牙中有41種揮發成分,冰糖籽48種,大青皮甜41種,大紅皮甜39種。其中烯烴類物質在大馬牙、冰糖籽和大青皮甜三個品種中的種類和含量均為最高,尤其是在冰糖籽和大青皮甜中所占比例達到67.3%和71.4%,是這幾個品種石榴的主要香氣構成體。其中主要的物質為β-蒎烯(清香)、對傘花烴(清香、柑橘香、香料香)、檸檬烯(檸檬味、柑橘味)、γ-萜品烯(脂香、木香)、石竹烯(辛香、木香、柑橘香)、反式-α-香柑油烯(花香),是構成石榴果香、清香味的主要成分。其次醇類物質在石榴的香氣構成上也做出了較大貢獻,尤其在大紅皮甜中的含量為最高為21.4%,在另三個品種中的所占比重也僅次于烯烴類物質,其中主要包括己醇(椰子香)、月桂醇(紫羅蘭香)等。另外酯類、酸類等成分也占有較大的比重。據文獻報道[18],石榴品種的關鍵風味物質為β-蒎烯、對傘花烴、檸檬烯、己烯醇、石竹烯、cis-3-己烯醇等,與本文基本相符。

四個石榴品種共有的揮發成分共20種。共有成分在大馬牙中占峰面積55.44%,冰糖籽中占54.39%,大青皮甜中占63.99%,大紅皮甜中占45.99%。這些共有成分組成了石榴果實的共同特征香氣，而其中相對含量較高的右旋檸檬烯、反式-α-香柑油烯、石竹烯、草酸環己基甲基十三酯、β-蒎烯和反-2-十四烯-1-醇為共有的關鍵香氣成分。

2.6 石榴樣品與其揮發物質的雙向聚類分析

雙向聚類分析是對矩陣的行與列同時進行聚類的一種數據挖掘技術,可以對聚類對象和聚類的屬性同時聚類,相較傳統聚類方法增加了一個計量維度[19]。

圖5顯示了石榴樣品與石榴揮發成分兩個維度的聚類結果。聚類圖形的行聚類表示的是對石榴品種的聚類,列聚類表示的是石榴揮發成分的聚類。

應用歐氏距離,基于離差平方和法對數據進行聚類分析的結果如圖5。對于石榴品種的行聚類,按一定的分組閾值,可以將4個石榴品種分成不同的組,在剩余信息為65%時可以將四個品種分為3類,冰糖籽與大青皮甜為一類;在剩余信息為50%時共分為兩類,冰糖籽與大青皮甜為一類,大馬牙與大紅皮甜為一類。分類表明,從揮發成分上分析不同品種的石榴有各自品種的獨特性及差異性[20]。

圖5 4種石榴品種與68種揮發成分的雙向聚類圖Fig.5 Dendrogram of two-way cluster analysis of pomegranate varieties and 68 volatile component注:圖左側S1為大馬牙;S2為冰糖籽;S3為大青皮甜;S4為大紅皮甜。圖右側橫坐標序號同表1。

對于揮發物的列聚類,在剩余信息為10%時將揮發成分分為四類,乙醛、左薄荷腦、甲氧基苯基肟和1-丁氧基-戊烯被分為一類,大紅皮甜中的十八烯與含氧物質如醇、醛、酯和酮類物質等被分為一類,冰糖籽中的13種獨立成分被分為一類,絕大多數的烯類與2-十四碳烯-1-醇、萜烯醇被分為一類。在剩余信息為5%時將上述四種分類合并成兩類,前兩種合為一類,后兩種合為一類。

石榴果實在感官上以清香為主,其風味構成物質種類眾多,主要包括醛類、酮類、醇類、烯烴類等。Antonio等[21]從石榴中檢測到的揮發性風味成分以萜烯類為含量最高,包括月桂烯、壬醛、乙酸辛酯等,與本文研究基本相符。苑兆和等[10]在石榴果實中檢測出42種香氣成分,其中以醛類和醇類為主,與本文稍有出入,原因可能是果實生長環境的改變及品種差異造成的。

3 結論

本文采用HS-SPME結合GC-MS分析,對棗莊四種主產品種石榴進行了香氣成分的鑒定,對其萃取條件進行優化,通過雙向聚類分析對石榴品種及揮發成分進行分類。通過對固相微萃取條件篩選,確定選用65 μm PDMS/DVB萃取頭,在萃取溫度60 ℃,萃取時間30 min,解析時間3 min的條件進行下提取分離。在四種不同品種石榴中共分離鑒定出68種揮發成分,共有揮發成分20種，其中相對含量較高的右旋檸檬烯、反式-α-香柑油烯、石竹烯、草酸環己基甲基十三酯、β-蒎烯和反-2-十四烯-1-醇為共有的關鍵香氣成分。每個品種也有各自特有的香氣成分,大馬牙、冰糖籽、大青皮及大紅皮分別共有1種、13種、1種和7種獨立香氣成分,它們構成了不同品種各自獨特的風味特點。雙向聚類分析將4種石榴品種在剩余信息為65%時分為3類,揮發性成分在剩余信息為10%時將揮發成分分為四類。

對于不同品種石榴的揮發性物質進一步可采用人工感官鑒評與電子鼻等設備方法進行進一步的研究。

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