美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠肝損傷的改善作用

肖艷紅,徐 倩,周曉慧,劉 楠,茍子薇,李素婷,*

(1.承德醫學院生物化學教研室,河北承德 067000; 2.承德市中心醫院,河北承德 067000)

2型糖尿病(T2DM)是由于胰島素抵抗導致胰島素信號傳導通路受阻所引起的[1]。肝臟是人體代謝的中樞,長期的高血糖會造成肝臟氧化應激系統異常[2-4],出現肝損傷[5-7]。真菌多糖具有多種生理活性,如抗腫瘤、降血脂血糖、提高免疫力、抗氧化延緩衰老、抗菌、抗輻射等[8-11],從真菌中尋找和提取有活性的多糖一直是國內外食品與保健領域研究和開發的熱點。

美味牛肝菌(Boletusedulis),歸于牛肝菌屬、美味牛肝菌種,又稱大腳菇,是久負盛名的優質野生食用真菌,不但美味可口,營養豐富,還可藥用,深受人們的青睞[12-13]。牛肝菌可分為美味牛肝菌、黑牛肝菌、褐環粘蓋牛肝菌等[14],近來已有學者研究了幾種牛肝菌提取成分的功效,郭永月[15]與王建明[16]分別研究了黑牛肝菌多糖與褐環粘蓋牛肝菌的乙醇提取物對小鼠酒精性肝損傷及糖尿病有一定的改善,但未見美味牛肝菌多糖對T2DM大鼠肝損傷的保護作用的相關報道。

本研究采用高脂高糖飼料喂養聯合STZ腹腔注射法構建T2DM大鼠模型[17],研究美味牛肝菌多糖的降糖、降脂以及糖尿病性肝損傷的保護作用,以期為美味牛肝菌多糖相關保健食品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康清潔級Wistar大鼠 40只,雄性,體重180～200 g,12周齡,由北京華阜康科技股份有限公司提供,動物合格證號為SCXK(京)2009-0008,飼養于承德醫學院實驗動物中心,自由攝食水,室溫20～22 ℃,自然采光,通風良好;大鼠標準飼料及高脂高糖飼料 北京科澳協力飼料有限公司,其中高脂高糖飼料的配方為:豬油10%、蛋黃粉8%、膽固醇1.5%、蔗糖20%、膽酸鈉0.1%、標準飼料60.4%;牛肝菌 承德潤隆食品有限公司,批號20120906003,牛肝菌于恒溫箱50 ℃烘干至恒重,并用植物粉碎機粉碎過80目篩制成粉末備用;牛肝菌多糖 由承德醫學院生物化學教研室制備;鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司,用時溶解于0.1 mol/L(pH=4.3)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,現用現配;鹽酸二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司,0.5 g/片,批號1311123;血糖儀及配套試紙 三諾生物傳感股份有限公司,批號1312085;甘油三酯(TG)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程公司,批號1708027;BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司,批號1705009;其他所用試劑 均為分析純。

WSZ-133-65型電熱恒溫水浴鍋 上海東星建材實驗設備有限公司;旋轉蒸發器 RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 石家莊陽星儀器貿易有限公司;LGJ-22D型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;722可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;BFM-6A型植物粉碎機 濟南倍力粉技術工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肝菌多糖的提取 參照文獻[18-20],準確稱量牛肝菌粉末15.0 g,加300 mL石油醚于70 ℃水浴鍋中脫脂1.5 h后抽濾。脫脂后的牛肝菌加水300 mL于100 ℃水浴鍋中加熱1.5 h,4000 r/min離心10 min。沉淀再次加水加熱后4000 r/min離心10 min,兩次上清液置于旋轉蒸發儀進行濃縮,濃縮比為5∶1,向濃縮液中加入無水乙醇至醇濃度為80%。低溫靜置過夜后4000 r/min離心10 min,將上層酒精萃取液再次用旋轉蒸發儀進行濃縮、80%醇沉、4000 r/min離心10 min,共重復三次。收集沉淀,即得牛肝菌多糖。-40 ℃低溫冷凍48 h干燥,稱量凍干膏,并計算多糖含量。采用苯酚-硫酸法[21]測定牛肝菌多糖提取物中多糖含量,以葡萄糖作標準曲線。回歸方程為Y=11.732X,R2=0.996,說明線性關系良好。凍干膏中多糖含量(%)=多糖質量/凍干膏質量×100,經測定多糖含量為53.83%。

1.2.2 T2DM大鼠模型的建立及分組 取40只大鼠,隨機分為正常組(A)、模型組(B)、牛肝菌多糖低劑量組(C)、牛肝菌多糖高劑量組(D)和二甲雙胍陽性藥物對照組(E),每組8只。標準飼料正常飼養1 w后,B、C、D、E組給予高脂高糖飼料進行造模,為期28 d,第29 d禁食12 h,一次性腹腔注射35 mg/kg·bw STZ;A組繼續給予標準飼料后注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后經內眥眼眶后靜脈叢采血,測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。各組分籠飼養,A、B組給予生理鹽水灌胃,C、D組給予牛肝菌多糖(200、400 mg/kg·bw),E組給予二甲雙胍(200 mg/kg·bw),1次/d,連續給藥4 w。

1.2.3 指標的測定 給藥前、末次給藥后兩次各組大鼠內眥眼眶后靜脈叢采血,使用血糖儀配備試紙測定各組大鼠空腹血糖(GLU);給藥結束后麻醉大鼠,腹主動脈取血,血樣4 ℃靜置2 h,3000 r/min離心10 min后取上清,根據試劑盒說明書測定各組大鼠血清中TG、ALT與AST;處死大鼠后稱量體重及肝臟濕重,參照文獻[22],計算各組大鼠肝臟指數,肝臟指數=(肝臟重量/體重)×1000;取肝臟,利用生理鹽水制備10%肝勻漿,3000 r/min離心10 min后取上清,測定CAT、SOD、GSH-Px、GSH、MDA,具體操作步驟參照各種試劑盒說明書進行。

1.3 數據處理

結果采用SPSS 19. 0統計軟件進行分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用q檢驗。以p<0.05表示差異具有統計學意義,p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠血糖含量的影響

由表1可知,給藥前4個造模組大鼠血糖含量均高于16.7 mmol/L,并顯著高于正常組(p<0.01),說明造模成功。與給藥前比較,給藥4 w后,牛肝菌多糖低、高劑量組大鼠與二甲雙胍組大鼠血糖含量均顯著降低(p<0.01),并均顯著低于模型組(p<0.05),且牛肝菌多糖高劑量組與陽性藥物二甲雙胍組大鼠血糖含量無顯著性差異(p>0.05)。以上結果表明,美味牛肝菌多糖能夠降低T2DM大鼠血糖含量,高劑量組降糖效果與二甲雙胍相近。

表1 美味牛肝菌多糖對大鼠血糖含量的影響Table 1 Effects of Boletus edulis polysaccharides on blood glucose contents of

2.2 美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠體重與肝臟指數的影響

如表2所示,與正常組比較,模型組大鼠的體重顯著減輕(p<0.01),并顯著低于3組藥物組(p<0.01);肝臟指數顯著升高(p<0.01),并顯著高于3組藥物組(p<0.01),且牛肝菌多糖高劑量組與二甲雙胍組大鼠的體重與肝臟指數均無顯著性差異(p>0.05)。以上結果表明,美味牛肝菌多糖能改善糖尿病“三多一少”中體重減輕的癥狀,并有效降低肝臟指數,減輕脂肪在肝臟的堆積。高劑量組與二甲雙胍組作用效果相當。

表2 美味牛肝菌多糖對大鼠體重及肝臟指數的影響Table 2 Effects of Boletus edulis polysaccharides on body weight and liver index of

2.3 美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠血清TG含量與ALT、AST活力的影響

由表3可知,與正常組比較,模型組大鼠血清中TG含量與ALT、AST的活力均顯著升高(p<0.01),并顯著高于3組藥物組(p<0.01),且牛肝菌多糖高劑量組與二甲雙胍組大鼠的各項結果均無顯著差異(p>0.05)。以上結果表明,美味牛肝菌多糖能減少T2DM大鼠血脂含量,減輕肝臟細胞損傷,降低血清中肝內酶的活力,高劑量組與二甲雙胍組功效相近。

表3 美味牛肝菌多糖對大鼠血清TG含量與ALT、AST活力的影響Table 3 Effects of Boletus edulis polysaccharides on TG contents and activities of ALT and ASTin serum of

2.4 美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠肝臟CAT、SOD與GSH-Px活力的影響

由表4可知,與正常組比較,模型組大鼠肝臟中CAT、SOD和GSH-Px活力均顯著降低(p<0.01);與模型組相比,3組藥物組大鼠肝臟中CAT、SOD 和 GSH-Px活力均顯著升高(p<0.01)。其中,牛肝菌多糖高劑量組大鼠肝臟中CAT、SOD和GSH-Px活力顯著高于二甲雙胍處理組大鼠(p<0.01)。以上結果表明3組藥物能夠改善T2DM大鼠肝臟組織中CAT、SOD等抗氧化酶活力。

表4 美味牛肝菌多糖對大鼠肝臟CAT、SOD與GSH-Px活力的影響Table 4 Effects of Boletus edulis polysaccharides on activities of CAT,SOD and GSH-Px in liver of protein)

2.5 美味牛肝菌多糖對2型糖尿病大鼠肝臟GSH與MDA含量的影響

如表5所示,與正常組比較,模型組大鼠肝臟組織中GSH含量明顯降低,但MDA的含量顯著升高(p<0.01);與模型組相比,3組藥物組大鼠肝臟組織中GSH含量顯著升高,而MDA含量顯著降低(p<0.01)。其中,牛肝菌多糖高劑量組大鼠肝臟組織中GSH含量顯著高于二甲雙胍組大鼠,MDA的含量顯著低于二甲雙胍組大鼠(p<0.01)。以上結果表明,3組藥物能夠提高T2DM大鼠肝臟中抗氧化物質GSH的水平,降低過氧化產物MDA的含量,美味牛肝菌多糖高劑量組的效果優于二甲雙胍。

表5 美味牛肝菌多糖對大鼠肝臟 GSH與MDA含量的影響Table 5 Effects of Boletus edulis polysaccharides on GSH and MDA contents in liver of

3 討論

本研究通過建立T2DM大鼠模型,探討美味牛肝菌多糖對T2DM大鼠肝臟的保護作用。結果表明,與模型組相比,美味牛肝菌多糖處理組大鼠的GLU(p<0.05)和TG(p<0.01)含量均顯著降低,表明美味牛肝菌多糖具有較好的降血糖降血脂作用[23];肝臟指數明顯降低,表明美味牛肝菌多糖能夠促進糖脂代謝[24],減少脂肪在肝臟的堆積[25-26];肝臟抗氧化酶系CAT、SOD、GSH-Px的活力和非酶抗氧化物質GSH的含量顯著升高(p<0.01),且脂質過氧化產物MDA的含量顯著降低(p<0.01),進一步表明美味牛肝菌多糖可以通過恢復肝臟氧化應激系統功能[27-28],提高肝臟抗氧化能力,抵御過氧化物的攻擊,清除各種自由基,減輕肝臟細胞膜脂質過氧化的程度[29];ALT、AST是存在于肝細胞內的代謝酶類,血清中ALT、AST的活力可直接作為肝功檢測的指標[30],美味牛肝菌多糖組大鼠血清ALT、AST的活力顯著降低充分說明美味牛肝菌多糖可以保護肝臟組織,減輕肝細胞炎癥、壞死等損傷,維持肝細胞膜結構的完整性[31]。美味牛肝菌多糖高劑量組大鼠肝臟組織中CAT、SOD、GSH-Px的活力與GSH的含量均顯著高于陽性藥物二甲雙胍組大鼠,且MDA的含量顯著低于二甲雙胍組大鼠,說明美味牛肝菌多糖對減輕T2DM大鼠的肝損傷有顯著的功效,且有一定的劑量依賴性。以往研究大多為關于美味牛肝菌多糖提取方法的優化,體外檢測抗氧化能力等,未見有關美味牛肝菌多糖對大鼠糖尿病性肝損傷影響的報道。本研究表明，美味牛肝菌多糖能夠改善T2DM大鼠的肝損傷,可為將美味牛肝菌多糖開發為預防治療T2DM的保健品提供新的思路。但究竟美味牛肝菌多糖中何種組分實現其降糖功能,以及影響糖代謝途徑中哪些基因的表達等問題,有待深入的探討。

4 結論

美味牛肝菌多糖通過降糖、降脂,提高T2DM大鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力和GSH的含量,抵抗自由基及各種過氧化物的攻擊,降低了血清ALT、AST活力與肝臟MDA的含量,對T2DM大鼠的肝損傷有極大的保護作用,但其具體機制還需進一步研究。

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