遠華蟾毒精對體外乳腺癌4T1細胞上皮 間質轉化的影響*

高玉雪 曹珍 呂世軍 朱學濤 李峰 王茹燕 徐金媛 鐘瑾怡 史立宏

(濰坊醫學院， 山東 濰坊 261053)

乳腺癌是世界范圍內導致女性死亡的常見惡性腫瘤[1-2]。盡管綜合檢查和各種治療方法應用于乳腺癌患者，在侵襲與轉移方面臨床效果仍不理想[3]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)不僅參與胚胎生長[4]，而且與惡性腫瘤的侵襲與遷移密切相關[5]。遠華蟾毒精是傳統中藥，具有免疫調節、強心和抗腫瘤的作用[6-8]。前期研究發現，遠華蟾毒精可抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉移。因此，本研究進一步觀察遠華蟾毒精對乳腺癌上皮間質轉化的影響，并進一步探討其作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 鼠乳腺癌4T1細胞購自美國ATCC公司，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維鏈接蛋百(Fibronectin)抗體購自英國Abcam公司，snail, Akt, P-Akt, m-TOR and P-mTOR購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 4T1細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中進行培養，置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養。細胞長至75%時，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 收集處于對數期4T1細胞，制成4×104個/ml細胞懸液， 100μl接種于96孔細胞培養板中，置于37℃、5% CO2培養箱中過夜培養。設置對照組與實驗組，每組3個復孔。實驗組每孔加175μl濃度分別為0.05、0.1、0.5、1和1.25μg/ml的遠華蟾毒精，對照組不加藥；空白對照組只加入培養基。培養24 h后，每孔加入10μl的MTT溶液，繼續培養4 h。小心吸去培養液，每孔加入100μl二甲基亞砜，置于搖床上低速震蕩10min。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

1.2.3 細胞劃痕實驗 收集處于對數期4T1細胞，5×105個/孔接種6孔細胞培養板，置于37℃、5% CO2培養箱中過夜培養。用滅菌的10μl槍頭均勻劃痕，PBS洗3次。設對照組和實驗組，實驗組培養液含遠華蟾毒精濃度分別0.05和0.5μg/ml，各設3個復孔。分別0和24h后用顯微鏡( ×40) 觀察并拍照，比較對照組與實驗組的遷移程度，測量遷移距離，并計算遷移率。

1.2.4 Transwell侵襲及遷移實驗 將Matrigel膠融化后用預冷的無血清1640按1：19稀釋，每個小室加入50μl稀釋后的Matrigel，37℃、5% CO2培養箱孵育1h。以5×105/ml的密度將細胞重懸于無血清的1640培養液中，上室接種200μl細胞懸液，實驗組藥物濃度為0.05和0.5μg/ml，對照組不加藥；下室加入600μl含10%胎牛血清的1640，37℃、5% CO2培養箱孵育24h。吸出上室液體，PBS洗滌3次，棉簽擦凈濾膜上室面細胞，將遷移到膜下室面細胞用4%多聚甲醛固定30min，1%結晶紫染色10min。對于遷移實驗，除小室內不鋪Matrigel，其他步驟與侵襲實驗相同。

1.2.5 免疫熒光 取出24孔板，放入已滅菌的爬片，收集處于對數期4T1細胞，2×104個/孔接種于爬片上，37℃、5% CO2培養箱孵育過夜。實驗組藥物濃度為0.5μg/ml，對照組不加藥，37℃、5% CO2培養箱孵育24h。4%多聚甲醛固定爬片30min；0.5%TritonX-100室溫通透20min；山羊血清室溫封閉1h。滴加相應一抗60μl，放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜。避光滴加熒光二抗，在濕盒中37℃孵育1h。復染核，避光滴加DAPI，在濕盒中室溫孵育10min。吸干爬片上的液體，用熒光防淬滅劑將爬片粘到載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 蛋白質提取及蛋白質印跡檢測 收集對照組與實驗組(0.05和0.5μg/ml)遠華蟾毒精處理的4T1細胞，加入預冷裂解液，冰上裂解后，4℃12000rpm離心5min，BCA法測濃度，蛋白質樣品與上樣緩沖液混合，100℃沸水中煮5min，置于-20℃保存。然后在SDS-PAGE膠中進行電泳，電泳結束后將膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉37℃封閉1h后， 孵育相應一抗4℃過夜。TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗，室溫孵育1h。TBST洗膜3次，10min/次，ECL化學顯色。

2 結果

2.1 遠華蟾毒精對4T1細胞增殖影響 MTT試驗結果，抑制率= [(對照組平均OD值一實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值一空白對照組平均OD值)]×100%，觀察組不同濃度(0.05、0.1、0.5和1μg/ml)遠華蟾毒精對細胞增殖的抑制率分別為(5.4±3.4)%、( 8.0±3.5)%、(10.2±3.5)% 和(13.0±6.8)%，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；濃度分別為1.25和1.5μg/ml的遠華蟾毒精對細胞增殖的抑制率分別( 38.8±8.8)%和(64.3±14.0)%，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。低濃度遠華蟾毒精對細胞增殖影響不明顯，因此采用0.05和0.5μg/ml的遠華蟾毒精進行實驗。

2.2 遠華蟾毒精對4T1細胞遷移影響 劃痕實驗結果，24h后，對照組、0.05和0.5μg/ml實驗組細胞劃痕遷移率分別為(85.8±5.2)%、(49.3±4.5)%和(30.3±4.5)%，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。遠華蟾毒精抑制4T1細胞遷移，且呈濃度依賴性。

2.3 Transwell遷移與侵襲實驗 Transwell遷移實驗結果，24h后，對照組、0.05和0.5μg/ml實驗組穿至下室的細胞數分別為(181.7±16.7)、(88.0±11.6)和(32.7±5.2)，差異具有統計學意義(P<0.05)；且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

Transwell侵襲實驗結果，24h后，對照組、0.05和0.5μg/ml實驗組穿至下室的細胞數分別為(142.2±14.9)、(55.2±9.3)和(27.5±7.1)，差異均有統計學意義(P<0.05)；且兩兩比較差異具有統計學意義(P<0.05)。Transwell遷移與侵襲實驗表明，遠華蟾毒精對4T1細胞遷移與遷移具有抑制作用，且呈濃度依賴性。

2.4 遠華蟾毒精抑制4T1細胞EMT標志物及相關信號通路蛋白的表達 免疫熒光結果顯示，24h后，0.5μg/ml遠華蟾毒精與對照組相比，上皮標志物E-cadherin表達增強，間質標志物Vimentin和Fibronectin表達減弱，見圖1。

圖1 遠華蟾毒精對EMT相關標志物的影響 Figure 1 The effects of telocinobufagin on EMT related markers注：紅色代表E-鈣粘蛋白；綠色代表波形蛋白和纖維連接蛋白

蛋白質印跡法結果，E-鈣粘蛋白在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(1.65±0.27)、(2.65±0.30)、(3.55±0.36)，差異具有統計學意義(P<0.05)，實驗組與對照組相比，上皮標志物E-cadherin表達增強；波形蛋白在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(1.81±0.18)、(1.20±0.13)、(0.56±0.07)，差異均有統計學意義(P<0.05)；纖維鏈接蛋白在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(6.96±1.75)、(3.78±0.87)、(1.52±0.69)，差異均有統計學意義(P<0.05)；轉錄因子Snail在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(0.67±0.12)、(0.34±0.07)、(0.21±0.04)，差異均有統計學意義(P<0.05)；間質質標志物波形蛋白和纖維連接蛋白以及轉錄因子Snail表達減弱。P-AKT在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(1.15±0.07)、(0.56±0.06)、(0.32±0.03)，差異具有統計學意義(P<0.05)；p-mTOR在對照組(0μg/ml)與實驗組(0.05和0.5μg/ml)的相對表達量分別為(1.27±0.09)、(0.65±0.10)、(0.27±0.05)，差異均有統計學意義(P<0.05)，磷酸化Akt和mTOR表達減弱。

3 討論

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤， 也是引起婦女死亡的主要原因, 且發病率呈逐年遞增趨勢[9]。然而，大多數患者的主要致死因素不是原發腫瘤，而是乳腺癌的遠處轉移。

上皮間質轉化是指上皮細胞在特定生理與病理條件下轉變成為具有遷移能力的間質表型細胞的過程。EMT不僅參與人體正常的生物學過程，如胚胎的發生和發育、組織重建以及纖維化，而且與腫瘤轉移過程有密切關系[10,11]。EMT在乳腺癌的發生、發展中起最重要的作用，同時也參與了轉移、侵襲過程，并影響患者對治療的反應性，也可降低患者生存率[12]。E-cadherin、Vimentin和Fibronectin是EMT典型的標志物[13-14]。轉錄因子Snail與EMT相關，調節乳腺癌細胞的侵襲與轉移[15-16]。當腫瘤發生EMT時， 細胞與細胞間的黏附能力降低，E-cadherin表達下降，Vimentin和Fibronectin表達增強，腫瘤的侵襲與轉移能力增加[17-18]。

PI3K-Akt 信號通路誘導腫瘤EMT的發生，參與侵襲轉移等多種生物學過程[19]。PI3K/AKT信號可上調細胞內 Snail轉錄因子的表達，下調E鈣黏蛋白的表達，誘導乳腺癌發生EMT[20]。

近年來，中藥單體對腫瘤的治療效果越來越顯著，關注程度逐漸增加。遠華蟾毒精是從蟾酥中提取的單體化合物，具有抗腫瘤和免疫調節等作用。為了研究遠華蟾毒精對乳腺癌侵襲、轉移和EMT的影響，該實驗選擇具有高侵襲能力的鼠乳腺癌4T1細胞，進一步揭示遠華蟾毒精對乳腺癌侵襲轉移的體外抑制作用。MTT實驗結果顯示，低濃度遠華蟾毒精對4T1細胞增殖有抑制作用，但效果不明顯；高濃度遠華蟾毒精能明顯抑制4T1細胞增殖。劃痕實驗、Transwell遷移與侵襲實驗結果表明，與對照組相比，遠華蟾毒精抑制4T1細胞的侵襲與轉移；且抑制作用具有濃度依賴性。免疫熒光與蛋白質印跡法結果共同揭示，與對照組相比，遠華蟾毒精上調上皮表型E-cadherin，下調間質表型Vimentin和Fibronectin。遠華蟾毒精也抑制了轉錄因子Snail、p-Akt和p-mTOR的表達。從分子水平說明遠華蟾毒精抑制4T1細胞EMT，通過Akt/mTOR信號通路，下調轉錄因子Snail，進而降低下游靶蛋白Vimentin和Fibronectin的表達以及增加E-cadherin的表達，抑制4T1細胞的遷移與轉移能力，從而達到抑制腫瘤侵襲與轉移的作用。

4 結論

遠華蟾毒精通過Akt/mTOR/Snail信號通路抑制乳腺癌的遷移、侵襲及EMT，為遠華蟾毒精的臨床應用提供了理論依據。

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