鹽酸戊乙奎醚、右美托咪定對大鼠急性肺損傷的保護作用

孟志鵬，劉靜，胡四平，童飛，龔浩杰

內毒素（LPS）導致的膿毒血癥是全身炎癥反應綜合癥，肺臟是膿毒癥時最先受到攻擊的靶器官，發(fā)生率高達83%～100%，可引起急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）甚至多器官功能障礙綜合征（MODS）[1]。目前ALI的研究證明炎性反應失衡是ALI的根本原因之一，臨床最基本的治療方法也以控制感染為主，抗感染治療和臟器保護方面都已經(jīng)取得巨大的進步，但迄今為止ALI/ARDS病死率仍高達30%～40%[2]。右美托咪定（DEX）是一種高選擇性-2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠又不抑制呼吸等特殊優(yōu)勢，特別是在膿毒癥患者急性肺損傷呼吸機支持治療時[3]。DEX還具有獨特的抗炎、抗氧化和肺保護作用[4-5]，能減輕呼吸機相關性肺損傷[6]。鹽酸戊乙奎醚（PHC）是新型莨菪堿類抗膽堿藥[7]，國內已有研究表明鹽酸戊乙奎醚作用于M1、M3受體，降低膽堿能神經(jīng)的張力，使支氣管平滑肌松弛，支氣管擴張，減少分泌物，降低氣道阻力和增加呼吸流量，改善氣道壓力，增加肺順應性減緩急性肺損傷的進展[8-9]，對各種類型的肺損傷具有一定的保護作用。本研究旨在比較PHC及DEX對LPS致大鼠ALI的保護性作用，以期為臨床ALI的治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年清潔健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體質量250～300g，由浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心提供 [動物使用許可證號：SYXK(浙)2014-0001]，于室溫22～24℃、分組分籠安靜環(huán)境下適應性喂養(yǎng)，每籠 3～4只，模擬晝夜交替12 h，可自由飲食飲水，適應環(huán)境1周。

1.2 模型制備與分組 大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后稱重，仰臥位固定于墊有保溫毯的操作臺上，待其體痛反射消失后用0.7 mm穿刺針（蘇州BD醫(yī)療器械公司）行右股靜脈、右頸內動脈置管。大鼠術中自主呼吸保留。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組10只：0.9%氯化鈉注射液組（對照組），經(jīng)右股靜脈給予等量0.9%氯化鈉注射液；LPS處理組（LPS組），右股靜脈按6mg/kg注射LPS（美國Sigma公司）；DEX治療組（L+D組），右股靜脈注射等量LPS0.5h后2min內同樣通過右股靜脈注射DEX 50g/kg（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號：16060132），隨后以 5g·kg－1·h－1微量注射泵泵入；PHC治療組（L+P組），右股靜脈注射等量LPS 0.5 h后2 min內同樣通過右股靜脈注射PHC1mg/kg（成都力思特制藥股份有限公司，批號：H20080606），隨后以1g·kg－1·h－1微量注射泵泵入。

1.3 標本采集與檢測 大鼠注射0.9%氯化鈉注射液或LPS 6 h后實驗結束，右頸動脈采血2 ml后放血處死，血液經(jīng)肝素抗凝后，4℃下以2 000 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定腫瘤壞死因子-（TNF-）水平，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司（批號：70-EK3822/2）；測定包細胞介素-1（IL-1）、包細胞介素-6（IL-6）含量，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司（批號：70-EK3062/2）。胸部備皮消毒后置于無菌操作臺上,嚴格無菌操作，依解剖結構打開胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)右心室插管至肺動脈，用0.9%氯化鈉注射液快速沖洗后取右肺上葉4mm×4mm組織，將其置于4℃4%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片（厚度5m），HE染色，光鏡下行肺組織病理學檢查，并從中性粒細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔內出血及肺泡腔滲出四方面按嚴重程度行彌漫性肺泡損傷標準（DAD）評分（正常：0分；輕度：1分；中度：2分；重度：3分）[10]；取右肺中葉組織，濾紙吸盡表面水分，用電子分析天平稱濕重（W），然后置80℃電熱干燥箱內烘烤24 h左右，待質量恒定后稱干重（D），計算肺組織濕/干重比值（W/D）。分離氣管，夾閉右支氣管，分3次用4℃0.9%氯化鈉注射液按20ml/kg行左支氣管肺泡灌洗，并回收左支氣管肺泡灌洗液（BALF），并于4℃下以1 200 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，用ELISA法測定BALF的TNF-、IL-6含量，用蛋白定量法（BCA）測定總蛋白含量（TP），試劑盒購自碧云天生物研究所（批號：P0012）。

1.4 統(tǒng)計方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用 檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

組血漿TNF-、IL-1及IL-6均高于對照組（19.3，均＜0.05）；L+D組、L+P組血漿TNF-、IL-1、IL-6均低于ALI組（22.3，均P＜ 0.05）；L+P 組與L+D組差異無統(tǒng)計學意義（=0.05＞ 0.05）。見表1。

2.2 病理學觀察 光鏡下，對照組無明顯肺損傷，結構未見明顯異常，中性粒細胞浸潤少見；ALI組肺泡結構破壞嚴重，結構紊亂，大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔滲出伴有明顯出血；L+D組、D+L組組也有肺損傷，但較LPS組輕，肺泡結構破壞、間質中性粒細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔滲出、出血程度均較LPS組輕；D+L組各項指標較L+D組程度輕。見封四彩圖3。

2.3 DAD評分和W/D比較 3個實驗組DAD評分均高于對照組（13.598，均＜0.05）；L+D組與L+P組DAD評分均低于ALI組（≥50.596，均＜0.05）；L+P組與L+D組差異無統(tǒng)計學意義（=0.17，＞ 0.05）。3個實驗組 W/D均高于對照組（28.461，均＜0.05）；L+D組、L+P組W/D均低于ALI組（8.433，均＜0.05）；L+P組與L+D組差異無統(tǒng)計學（=0.88＞0.05）。見表2。

3 討論

LPS作用于肺內的內皮細胞、上皮細胞和巨噬細胞等，激活IL、TNF-和其他炎癥介質大量表達，促使中性粒細胞在肺組織內活化和聚集，產(chǎn)生大量氧自由基，引起肺毛細血管內皮損傷，完整性破壞，毛細血管屏障受損、滲漏，血管通透性增加，富含蛋白的液體滲入到肺泡腔，促使肺組織炎性滲出和肺泡損傷[11-12]。該試驗選擇股靜脈注射6mg/kg LPS制備大鼠ALI模型，出現(xiàn)特征性肺組織病理學改變，與對照組比較，實驗組大鼠病理學切片示肺組織損傷、大量中性粒細胞浸潤、肺泡腔內滲出、出血、肺泡間隔增寬，肺W/D值升高，DAD評分升高，表明成功制備了大鼠ALI模型。

表1 各組血清TNF-和IL-6水平比較 pg/ml

表2 各組DAD評分和肺組織W/D值比較

表3 各組肺泡灌洗液中TNF-、IL-6和TP比較

DEX是一種新型高選擇性-2腎上腺素受體激動劑，與-2受體結合后具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、不抑制呼吸等優(yōu)點在臨床得到廣泛使用[13]；PHC是一種新型抗膽堿藥，其抗膽堿能作用可減少腺體分泌和氣道阻力，增加肺順應性，緩肺毛細血管和支氣管平滑肌痙攣，改善局部微循環(huán)、減輕水腫，改善肺功能。還能穩(wěn)定細胞膜及溶酶體、線粒體等細胞器的膜結構，抑制 TNF-、IL-6等促炎因子釋放，減輕炎癥反應[14-15]。

TNF-是應激反應中起核心作用的最早促炎因子，是ALI發(fā)生發(fā)展的始動因素，是引起ALI最重要細胞因子之一，且與IL-1、IL-6具有協(xié)同作用，促進ALI發(fā)展。本研究靜脈注射LPS后，血清和BALF中上述炎癥因子的濃度都升高，提示LPS誘發(fā)大量炎癥因子生成和釋放，炎癥反應失控，體內的促炎和抗炎的動態(tài)平衡被打破，而肺組織是其攻擊的首要器官。給予DEX或PHC處理后，血清和BALF中炎癥因子濃度降低，且DEX或PHC治療效果無明顯差異，與對照組無差別水平，提示DEX或PHC可以抑制LPS致大鼠膿毒癥引起的炎癥因子的釋放，減輕LPS導致的肺組織炎性反應。本研究結果還表明，大鼠ALI模型成功制備后，病理切片提示肺組織一定程度的損傷，肺組織DAD評分、W/D值及BALF中的總蛋白升高，給予DEX或PHC處理后，病理切片提示肺組織損傷情況較LPS模型有明顯改善，肺組織DAD評分、W/D值及BALF總蛋白顯著下降，表明DEX或PHC治療可以降低肺泡水腫的程度，對ALI具有一定的保護作用，且DEX或PHC治療效果無明顯差異。

綜上所述，DEX和PHC都可以對LPS致大鼠ALI有保護作用，且效果相當。由于內毒素致大鼠急性肺損傷發(fā)生機制尚未研究透徹，DEX或PHC對急性肺損傷詳細的保護作用機制、給予不同時機、不同劑量的效果仍需進一步研究。

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