抗人IgM抗體對鼻咽癌HNE-1細胞生物學特性的影響

周 珊，劉彥婷，趙飛鵬，馮華君，涂曉敏，楊金亮，梁傳余，覃 綱△

(1.西南醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，四川瀘州 646000；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041；3.四川大學華西醫院耳鼻咽喉頭頸外科，成都 610041)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種頭頸部常見的惡性腫瘤，多起源于鼻咽黏膜的上皮，在西方國家發病率極低(0.5/100 000)，但高發于我國南方(30/100 000)[1]。經以放療為主的綜合治療，早期NPC患者5年生存率可達90%，而晚期NPC患者的5年生存率僅維持在70%左右，甚至更低[2]。因此，研究NPC的發病機制和尋找新的治療靶點具有重要的臨床意義。免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是一類重要的免疫球蛋白分子，經典的免疫學理論認為僅由B淋巴細胞產生。近年的研究發現，上皮來源的組織和細胞系也可以表達Ig，如IgA、IgG和IgM[3-4]。研究證實，IgM在多種人上皮來源的腫瘤細胞中高表達，可能參與腫瘤免疫反應[5]，在肝癌、前列腺癌和卵巢癌的篩選和診斷方面具有生物標志物的潛力[6-8]。然而，IgM在NPC中的表達和功能尚不明確。本研究旨在探討抗人IgM抗體對NPC HNE-1細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，并構建裸鼠移植瘤模型進行驗證，為NPC的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人鼻咽癌HNE-1細胞系由四川大學華西醫院實驗室提供；RPMI-1640和胎牛血清(FBS)購自美國Thermo公司；羊抗人IgM抗體、羊抗IgG純化免疫球蛋白和碘化丙啶(PI)均購自美國Sigma公司；3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)實驗試劑盒和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒均購自美國Promega公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京吉凱科技有限公司；兔抗人gp96多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人IgM多克隆抗體、生物素化羊抗IgG抗體、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組織化學SP試劑盒購自美國Santa Cruz公司；BALB/c-nu裸鼠(雌性)購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HNE-1細胞在37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵箱中采用含10% FBS+1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基培養。

1.2.2細胞增殖檢測 嚴格按照試劑盒說明書進行。濃度梯度檢測：取對數生長期的細胞，以2×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，棄培養液，分3組加藥：實驗組(100 μL含不同濃度羊抗人IgM抗體+含2.5% FBS的RMPI-1640)、IgG/磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(100 μL含相同濃度羊抗IgG或PBS+含2.5% FBS的RMPI-1640)、空白對照組(100 μL 含2.5% FBS的RMPI-1640)，羊抗人IgM抗體、羊抗IgG和PBS設置的濃度梯度均為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL，設置校正孔，未接種細胞，加入100 μL含2.5% FBS的RMPI-1640校正吸光度值(A值)，培養3 d后，加入20 μL MTS，酶標儀測490 nm處A值(A490值)。時間梯度檢測：種板、分組同前，培養24 h后，棄培養液，分3組加藥，每隔24 h加入20 μL MTS，酶標儀測A490值，連續測6 d。空白對照組調零，每組設3個復孔，重復3次；細胞增殖抑制率(%)=(1-處理組A490/空白對照組A490)×100%。

1.2.3細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測：將細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，含10% FBS的RPMI-1640培養24 h，棄上清液；分3組，對應分別加1 mL含已調整濃度為200 μg/mL的羊抗人IgM抗體、羊抗IgG或含有相同體積的PBS的2.5% FBS的RMPI-1640，繼續培養72 h；收集每孔細胞制成含(1～5)×106個細胞的單細胞懸液，離心，70%乙醇固定，加1 mL PI染液，調整細胞密度為5×105個/毫升，上機檢測及鋪片拍照；細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞總數/總細胞數)×100%。TUNEL試劑盒檢測：按試劑盒說明書進行，將細胞以2×103個/孔接種于96孔板中培養；陰性對照組以1 μL雙蒸水代替rTdT酶，陽性對照組以DnaseⅠ預處理細胞，通過熒光顯微鏡觀察拍照，將細胞核呈強藍色熒光的細胞作為陽性細胞；細胞凋亡指數(%)=(一個視野的凋亡細胞數/通過視野的細胞總數)×100%。

1.2.4細胞周期檢測 按照周期試劑盒說明書處理細胞，調整細胞密度為5×105個/毫升，流式細胞儀檢測紅色熒光，用Multicycle軟件分析。

1.2.5體內移植瘤實驗 將1×106個HNE-1細胞皮下接種于雌性BALB/c-nu裸鼠(4～5周齡)的右背腹側；建模成功后，隨機分成實驗組、IgG對照組和PBS對照組，分別于腹腔注射等量的羊抗人IgM抗體、羊抗IgG及PBS，每3天注射1次，每只裸鼠1.5 mg，共5次；每4天測腫瘤體積；在第5次給藥完成后1周處死裸鼠，剝離移植瘤，稱重。瘤體體積=(D×d2)/2，D為最長徑，d為最短徑。動物實驗得到西南醫科大學動物實驗倫理委員會的批準，批準號為201605045。

A：培養72 h后，3組細胞在不同濃度下的A490值曲線；B：培養72 h后，3組細胞在不同濃度下的增殖抑制率曲線；C：3組細胞在不同時間下的A490值曲線；D：3組細胞在不同時間下的增殖抑制率曲線；*：P<0.05，與PBS對照組、IgG對照組比較

圖1抗人IgM抗體抑制HNE-1細胞增殖

A：3組細胞PI染色后的凋亡形態觀察(×200)；B：流式細胞術測3組細胞凋亡的柱形圖；C：3組細胞TUNEL染色后的凋亡形態觀察(×200)；D：TUNEL染色后3組細胞凋亡的柱形圖；*：P<0.05，#：P<0.01，與實驗組比較

圖2抗人IgM抗體誘導HNE-1細胞凋亡

1.2.6免疫組織化學檢測 將石蠟包埋的移植瘤組織4 μm切片，按免疫組織化學SP試劑盒說明書進行；雙盲法觀察每張切片的陽性表達，細胞質呈黃棕色為陽性表達；每張切片選5個視野，顯微鏡(×400倍)下拍照，Image Pro-Plus 6.0圖像分析軟件檢測平均光密度(MOD)值。

2 結 果

2.1抗人IgM抗體對HNE-1細胞增殖的影響 與IgG和PBS對照組比較，不同濃度抗人IgM抗體培養HNE-1細胞72 h后，隨濃度的增加A490值減小，增殖抑制率增加，從濃度為50 μg/mL開始，A490值和增殖抑制率出現明顯差異，見圖1A、B。含100 μg/mL濃度的抗人IgM抗體培養HNE-1細胞6 d，結果顯示：A490值和增殖抑制率隨時間的增加而增加；與IgG和PBS對照組比較，實驗組從第3天出現明顯抑制，見圖1C、D。

2.2抗人IgM抗體對HNE-1細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果：濃度為200 μg/mL的抗人IgM抗體作用于實驗組HNE-1細胞，培養72 h后顯示，實驗組的凋亡率[(31.10±2.81)%]明顯高于IgG對照組[(6.56±1.14)%]和PBS對照組[(7.79±1.21)%]，差異有統計學意義(F=161.667 3，P<0.05)，見圖2B；并且用PI染色也可觀察到類似結果，見圖2A。TUNEL檢測結果：HNE-1細胞經含抗人IgM抗體培養基培養72 h后，細胞凋亡明顯，呈較強的綠色熒光，見圖2C；實驗組凋亡指數[(26.19±2.17)%]明顯高于IgG對照組[(4.18±0.27)%]和PBS對照組[(3.38±0.77)%]，差異有統計學意義(F=281.098 9，P<0.01)，見圖2D。

2.3抗人IgM抗體對HNE-1細胞周期的影響 流式細胞檢測結果顯示，與IgG對照組和PBS對照組比較，實驗組HNE-1細胞G1期細胞百分比減少、S期細胞百分比增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.05，與實驗組比較

圖3流式細胞儀檢測HNE-1細胞周期分布

2.4抗人IgM抗體對移植瘤的影響 裸鼠皮下接種HNE-1細胞，成功構建移植瘤模型，分3組(每組5只)，3組裸鼠在實驗期間均無死亡。實驗結果顯示：腹腔注射藥物結束后1周，實驗組的平均瘤體體積[(26.73±16.51)mm3]明顯低于IgG對照組[(204.97±151.88)mm3]和PBS對照組[(230.16±167.78)mm3]，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組的瘤體平均質量[(0.09±0.07)g]明顯低于IgG對照組[(0.35±0.10)g]和PBS對照組[(0.38±0.08)g]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。相對于IgG對照組和PBS對照組，實驗組的瘤體質量抑瘤率分別為74.29%和76.32%。

A：瘤體體積；B：瘤體質量；*：P<0.05，與PBS對照組、IgG對照組比較

圖4裸鼠移植生長情況

2.5移植瘤中IgM與糖蛋白96(gp96)的表達 將HNE-1移植瘤組織切片行免疫組織化學染色，結果顯示：IgM蛋白和gp96蛋白主要表達于細胞質中，呈棕黃色，見圖5；實驗組的IgMMOD值(0.01±0.01)明顯低于IgG對照組(0.06±0.03)和PBS對照組(0.05±0.03)，差異有統計學意義(P<0.05)；同樣，實驗組的gp96MOD值(0.05±0.01)明顯低于IgG組(0.10±0.03)和PBS對照組(0.11±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 免疫組織化學檢測瘤體中IgM和gp96蛋白的表達(×400)

3 討 論

目前，上皮來源的惡性腫瘤組織和細胞中Ig的生物學活性和潛在機制已成為腫瘤研究的熱點之一。如ZHENG等[3]研究發現，人上皮腫瘤細胞衍生的IgA輕鏈可以誘導S期增加，促進細胞生長。尿道上皮腫瘤中IgG的高表達可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡；抗IgG抗體可誘導其細胞凋亡，IgG也可抑制胰腺癌細胞凋亡，促進腫瘤生長[9]。QIU等[10]證實了腫瘤細胞分泌的IgG是細胞生存和生長所必需的，利用特異性羊抗IgG抗體可誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制裸鼠移植瘤的生長，提出腫瘤來源的IgG能促進腫瘤細胞的生長。最近，觀察到含特異性CDR3片段的反義重組載體能夠抑制結腸癌HT-29細胞中Ig表達，誘導細胞凋亡，成功地抑制腫瘤細胞的增殖，認為腫瘤來源的Ig能夠促進細胞增殖及生長，即腫瘤細胞衍生的Ig具有生長因子樣活性[11]。

同樣，本實驗結果也揭示了抗人IgM抗體可能具有抑制HNE-1細胞增殖和生長的作用，并且抗人IgM抗體能有效地誘導HNE-1細胞凋亡。ZHENG等[3]發現抗人Igα單克隆抗體封閉腫瘤細胞Ig的功能，抑制CNE-1和Hela細胞的生長活性，隨后進一步證實Igα能夠增加其惡性增殖能力，而且發現腫瘤來源的Igα可促進細胞周期進入S期。本研究結果顯示，抗人IgM抗體改變HNE-1細胞周期分布，阻滯于S期，G1期減少，與ZHENG等[3]結果一致。

gp96屬于熱休克蛋白90(HSP90)家族中的一個成員，能夠參與腫瘤抗原的合成、裝配及抗原提呈，與腫瘤特異性抗原肽結合形成gp96-肽復合物，激活抗腫瘤特異性免疫應答和免疫調節[12]。gp96在多種惡性腫瘤細胞中高表達，可能是惡性腫瘤診斷和免疫的靶點。研究表明，在喉癌組織高表達的gp96與喉癌的發生、發展和預后相關[13]。QIAN等[14]發現提取不同骨髓瘤細胞系分泌的gp96混合成疫苗，可抑制小鼠骨髓瘤的侵襲。以上研究證明gp96在腫瘤免疫治療中發揮重要的作用。有研究報道，肺癌組織中gp96和IgG高表達，可能二者共同參與腫瘤的免疫防御和逃逸[15]。在本實驗中構建裸鼠移植瘤模型，發現抗人IgM抗體可抑制移植瘤的生長，免疫組織化學檢測瘤體組織中IgM和gp96表達情況，發現實驗組中IgM和gp96表達明顯低于對照組(P<0.05)，提示抗人IgM抗體能抑制移植瘤的生長可能與抑制IgM和gp96蛋白表達有關。

綜上所述，抗人IgM抗體能抑制HNE-1細胞的增殖，促進細胞凋亡，阻滯細胞周期于S期，減少細胞的G1期，并可能通過抑制IgM和gp96蛋白的表達進而抑制裸鼠移植瘤的生長。本研究結果可能為抗NPC研究提供新的思路。

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