TGF-β/ILK信號通路在甲狀旁腺激素誘導血管內皮細胞向間質細胞轉化中的作用

李 寧，張克勤，彭侃夫

(1.重慶大學附屬中心醫院/重慶市急救醫療中心/重慶市第四人民醫院內分泌腎內科 400014； 2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院腎科，重慶 400038)

尿毒癥是慢性腎衰竭(chronic kidney disease，CKD)等多種腎臟疾病轉歸的最終形式。對尿毒癥患者機體產生嚴重致病作用的主要是潴留堆積的各種無機或有機分子，被稱為尿毒癥毒素。按來源來分，主要包括本來就需排泄的有毒物質和機體正常所需由于排除障礙導致含量劇增的物質，前者的代表性分子有尿素、肌酐，而甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是后者的典型代表[1]。筆者在前期研究中發現，PTH可以誘導人血管內皮細胞發生內皮細胞-間質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)[2]，既可以觀察到細胞形態發生纖維化轉變，又可以檢測到EndMT一系列標志分子的表達改變，包括血管內皮細胞標志分子血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)和CD31的表達降低，纖維細胞標志分子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達升高，提示尿毒癥患者血清中較高水平的PTH可能通過誘導血管內皮細胞發生EndMT來產生對心血管的損傷，但是其中的分子機制尚不清楚。近年來的研究發現，整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)作為轉化生長因子β(TGF-β)信號下游效應蛋白，其激活與EndMT密切相關[3-5]。因此，本研究進一步利用TGF-β及ILK的抑制劑，探討TGF-β/ILK通路在PTH誘導EndMT中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人主動脈血管內皮細胞(HAECs)及內皮細胞培養基購自美國Lifeline Cell Technology公司。PTH購自美國Anaspec公司(貨號：27080)，按照說明書溶解于無菌水中。TGF-β抑制劑SB431542、Pirfenidone(PFD)購自美國Selleck公司，ILK抑制劑Cpd22購自美國Millipore公司，均按照說明書溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。蛋白質印跡法(Western blot)所用抗體包括VE-cadherin(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：2500)，CD31(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：3528)，α-SMA(美國Abcam公司，貨號：ab5694)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國Proteintech公司，貨號：60004-1)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及刺激處理 取對數生長期的HAECs接種于6孔細胞培養板中(3×105個/孔)，置于CO2細胞培養箱中培養，同步靜止12 h后開始加入誘導刺激因素：PTH誘導組加入PTH至終濃度1×10-8mol/L，對照組加入等體積的注射用水；抑制劑組分別加入不同濃度的抑制劑，對照組和單獨加PTH的實驗組(PTH實驗組)同時加入DMSO(1∶1 000)作為抑制劑的溶劑對照。誘導刺激處理36 h后，收取各組細胞分別對各個標志分子的蛋白水平進行檢測。

1.2.2Western blot 吸去細胞培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入1×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液吹下細胞，轉移至EP管中，冰上超聲30 s，煮沸10 min，即為全細胞裂解液，于-80 ℃保存；取適量蛋白裂解液上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，冰浴條件下電轉移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉[Tris緩沖鹽水/吐溫(TBS/T)配制]室溫封閉2 h；加一抗工作液，4 ℃反應過夜；加辣根過氧化酶標記的二抗工作液，室溫反應1 h；化學發光法顯示目標條帶。采用Image J軟件對Western blot目標條帶進行灰度掃描。

2 結 果

2.1TGF-β抑制劑作用后HAECs內皮細胞標志物的表達 為了探討TGF-β通路在PTH誘導HAECs細胞發生EndMT中的作用，采用TGF-β的兩種抑制劑SB431542和PFD抑制TGF-β通路，檢測HAECs內皮細胞標志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改變。由圖1可見，1×10-8mol/L的PTH誘導刺激后，HAECs細胞中VE-cadherin和CD31的蛋白水平均出現明顯降低。隨著TGF-β抑制劑 PFD和SB431542的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有明顯的恢復，并且隨著抑制劑濃度的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表達水平也隨之升高。

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內參計算蛋白相對表達水平;*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖1 TGF-β抑制劑作用后HAECs內皮細胞標志物的表達

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖2 TGF-β抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達

2.2TGF-β抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達 進一步檢測HAECs中α-SMA蛋白水平在TGF-β抑制劑SB431542和PFD干預處理后的表達改變。由圖2可見，1×10-8mol/L的PTH誘導刺激后，HAECs細胞中α-SMA的蛋白表達水平出現了明顯升高。隨著TGF-β通路抑制劑SB431542和PFD的加入，α-SMA的蛋白水平出現了明顯的降低，并且隨著抑制劑濃度的增加，α-SMA的蛋白水平出現劑量依賴性下降，幾乎恢復到對照組的水平。

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖3 ILK抑制劑作用后HAECs內皮細胞標志物的表達

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖4 ILK抑制劑作用后HAECs纖維化標志物的表達

2.3ILK抑制劑作用后HAECs內皮細胞標志物的表達 為了探討ILK在PTH誘導HAECs細胞發生EndMT中的作用，采用ILK抑制劑Cpd22處理細胞，檢測HAECs內皮細胞標志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改變。由圖3可見，1×10-8mol/L的PTH誘導HAECs細胞中VE-cadherin和CD31蛋白水平出現明顯降低，隨著ILK抑制劑Cpd22的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有比較明顯的恢復，并且隨著抑制劑濃度劑量的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表達水平出現劑量依賴性的增加。

2.4ILK抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達 進一步檢測HAECs中α-SMA蛋白水平在ILK抑制劑Cpd22干預條件下的改變。由圖4可見，1×10-8mol/L的PTH刺激使HAECs細胞中α-SMA的蛋白水平出現明顯升高，隨著ILK抑制劑Cpd22的加入，α-SMA的蛋白表達水平出現明顯的降低，并且隨著抑制劑濃度劑量的增加，α-SMA的蛋白水平出現更加明顯的下降。

3 討 論

文獻表明，大多數早期和晚期CKD患者血清PTH水平明顯升高[6-7]。而PTH是由甲狀旁腺主細胞分泌的一種激素，主要調節人體鈣、磷代謝，對健康人體內沒有危害。但是，由于尿毒癥患者正常腎功能受損，不但引起PTH降解減緩，排泄也難以正常進行。因此，PTH不斷在患者體內積蓄。并且患者大多鈣磷代謝紊亂(由腎衰竭引起)，患者血清鈣離子水平降低、血磷水平升高，PTH在刺激下分泌增加，進一步誘發PTH的蓄集。這些變化，會導致多種并發癥，主要有繼發性甲狀旁腺功能亢進、皮膚瘙癢、轉移性鈣化、腎性骨病和周圍神經病變等。已有大量文獻報道，PTH受體存在于成纖維細胞和心肌細胞表面。此外，PTH也可作用于心肌。早期的研究發現，PTH是導致心肌間質纖維化的重要因素，而這由患者體內過高的PTH導致心肌間質的非修復性纖維化及膠原堆積引起。

細胞發生EndMT時，細胞丟失其內皮細胞標志蛋白VE-cadherin和CD31等，獲得性表達間充質細胞標志物α-SMA等[8-10]。本實驗結果表明，在PTH作用下血管內皮細胞HAECs的VE-cadherin和CD31表達降低(圖1、3)，而α-SMA的表達變化則相反(圖2、4)，說明PTH作為尿毒癥毒素，可以減弱HAECs的內皮細胞特征，同時增強纖維化的特征，誘導HAECs發生較明顯的EndMT。

TGF-β是一種生長調節因子，具有多種細胞生物學功能。TGF-β的分泌方式有多種，主要有自分泌、旁分泌及內分泌3種方式；TGF-β主要調控細胞分化、增殖、凋亡以及細胞外基質，也可深入調控組織形成、分化等；TGF-β可與細胞表面受體結合，從而傳導信號。研究發現，間質纖維化與TGF-β1功能密切相關，TGF-β1是誘導EndMT發生的關鍵因子之一[5,11-12]。有研究表明，TGF-β可誘導小鼠胚胎干細胞來源的EndMT[13]。此外，血管內皮細胞的增殖和表型轉化也可由TGF-β刺激產生，主要表型是成纖維細胞分子標志α-SMA水平升高、內皮細胞標志蛋白CD31表達則明顯下調[14-15]。本研究主要針對HAECs運用PTH刺激誘導，并額外使用TGF-β信號通路抑制劑SΒ431542和PFD。結果發現，PTH誘導HAECs發生的EndMT可被抑制劑SΒ431542和PFD逆轉，如HAECs內皮細胞標志分子減少(圖1)、纖維化分子標志增加(圖2)。結果提示，PTH誘導HAECs發生EndMT可能受到TGF-β信號通路的有效調控。

學術界已發現，TGF-β調控上皮間充質轉化(EMT)的發生，Smad依賴性及非Smad依賴性是兩種主要的信號通路[16]。非Smad依賴性通路涉及多種激酶通路，包括細胞外調節蛋白激酶-絲裂原活化蛋白激酶(ERK-MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和Rho激酶等[16]。最近的研究表明，與表型轉變相關的TGF-β信號下游蛋白主要是ILK[3]。SERRANO等[3]發現，當乳腺上皮細胞內發生EMT，往往伴隨ILK表達水平明顯升高，通過阻斷ILK可以有效逆轉轉化過程。上述研究表明，ILK是TGF-β1誘導EMT發生的極為重要的下游分子。另有研究嘗試對腎小管上皮細胞采用TGF-β1干預，結果發現腎小管上皮細胞原型丟失，間充質細胞標志表達則明顯升高，而這一表型變化可應用小分子QLT-0267(ILK抑制劑)有效抑制[17]。已有報道指出，內皮細胞與上皮細胞具有一定的同源性[9]，筆者前期的研究結果也發現HAECs的ILK水平可由PTH刺激升高[2]，為深入研究ILK在這一過程中的作用，筆者首先運用PTH誘導刺激HAECs，再加入小分子物質Cpd22(ILK抑制劑)干預，結果發現Cpd22可逆轉PTH引發的HAECs的內皮細胞分子標志物的減少和纖維化標志蛋白的增加。這一結果表明，ILK信號活化在PTH誘導HAECs發生EndMT過程中起著重要的作用。

綜上所述，PTH可明顯誘導出HAECs發生EndMT，而且TGF-β/ILK信號通路參與調控EndMT過程。從臨床價值來看，血管內皮細胞的EndMT可顯著降低血管彈性、增加血管硬化，導致心血管系統損傷，對機體造成很大的危害。未來TGFβ/ILK通路可能作為抑制血管內皮細胞發生EndMT的治療靶點，用于預防尿毒癥患者的心血管損傷。

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