雷帕霉素誘導Ana-1細胞自噬殺傷黑素化馬爾尼菲青霉

胡素俠，姚劍波，張榮波，楊立新

(1.安徽省淮南市第一人民醫院檢驗科 232007；2.江蘇省鹽城師范學院海洋與生物工程學院 224005；3.安徽理工大學醫學院免疫與檢驗教研室，安徽淮南 232001；4.安徽省淮南市第一人民醫院耳鼻喉科 232007)

馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)是一種雙相性機會致病真菌，在環境溫度中以菌絲相生長并通過分生孢子擴散，而在侵襲人或動物時的體溫條件下可呈酵母相存在于網狀內皮-巨噬細胞系統內，通過分泌色素及多種胞外酶抵抗宿主細胞的殺傷作用，長期存在于巨噬細胞內并分裂增殖[1-2]。在艾滋病患者、器官移植及大量使用糖皮質激素等免疫力低下的患者體內，PM可引發散播性感染[3-4]。由于PM對氟康唑等經驗性抗真菌藥物的治療敏感度不佳、易于誤診等原因該病的致死率較高[5]。黑素是多種病原真菌共有的毒力因子，通過抵抗巨噬細胞的吞噬功能和活性氧殺傷作用提高致病性，因而黑素化PM侵襲力更強、更易出現散播性感染，給馬爾尼菲青霉病的治療造成更大困難。

細胞自噬作為保守的胞內成分降解機制，通過降解廢舊蛋白、衰老細胞器，以及參與固有免疫與適應性免疫維持內環境穩態[6]。近年來已發現巨噬細胞的自噬活化在抵抗白假絲酵母、煙曲霉等常見侵襲性致病真菌中扮演重要角色，然而自噬在PM感染中發揮的作用未見報道[7-8]。筆者前期預實驗發現，巨噬細胞吞噬PM后自噬水平升高受限，而黑素化PM顯著抑制了巨噬細胞的自噬活化。基于自噬的抗真菌作用，本研究采用小鼠巨噬細胞系Ana-1細胞，探討通過經典的自噬誘導劑雷帕霉素激活巨噬細胞自噬抵抗黑素化PM的可行性，從而為該病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI-1640基礎培養基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)細胞消化液購自美國Hyclone公司；兔源抗LC3多克隆抗體、兔抗小鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG購自美國Invitrogen公司；雷帕霉素購自美國Selleck公司；左旋多巴胺(L-DOPA)、天門冬酰胺購自美國Sigma-Aldrich公司；腦心浸液(BHI)培養基購自美國Difco公司，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)為自行配置。Ana-1細胞系與PM菌株由安徽理工大學醫學院免疫與檢驗教研室保存。

1.2方法

1.2.1黑素化酵母相PM懸液的制備 將凍存的PM以三點法接種于PDA培養基進行復蘇，于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d，再以相同方法轉接3次純化菌種后，接種于BHI培養基斜面中37 ℃培養7 d，傳代3次，挑取少量菌種進行乳酸酚棉蘭染色，顯微鏡下觀察并計算酵母相細胞比例。酵母相細胞比例達到70 %以上后，在培養PM菌的BHI培養基斜面中加入2 mL含0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)，輕柔刮落菌落并渦旋5 min，靜置10 min后吸取上清液獲得懸液。配置含150 mL/L胎牛血清的RPMI-1640完全培養基，含多巴RPMI-1640完全培養基另加入0.1 g/L L-DOPA、1.0 g/L天門冬酰胺。將部分PM懸液轉接入含或不含多巴的完全培養基中，于電熱恒溫培養箱中37 ℃、200 r/min避光震蕩培養10 d，分別獲得黑素化或常規酵母相PM懸液。菌液用PBS洗滌3次后以RPMI-1640完全培養基重懸，調節菌液密度為1×107CFU/mL備用[9]。

1.2.2黑素化PM感染Ana-1細胞后LC3Ⅱ蛋白表達水平的檢測 以含100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青霉素-鏈霉素的RPMI-1640完全培養基常規培養Ana-1細胞。當倒置顯微鏡下觀察Ana-1細胞的匯合率為85%時，采用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化細胞，按2×105cells/cm2的密度在6孔細胞培養板中接種5組細胞：雷帕霉素對照組(A組)、白假絲酵母對照組(B組)、黑素化PM組(C組)、常規PM組(D組)和空白對照組(E組)。細胞培養過夜后，B、C、D組分別按感染復數約為8加入相應菌液共孵育3 h，A組以50 nmol/L雷帕霉素孵育48 h，E組加入等體積RPMI-1640完全培養基作為空白對照。孵育結束后以預冷的PBS洗滌細胞，裂解細胞后以GAPDH蛋白作為內參，采用蛋白質免疫印記法(Western blot)檢測LC3Ⅱ蛋白表達水平。免疫雜交時使用兔源抗LC3多克隆抗體(1∶1 000)、4 ℃條件下孵育過夜，PBST洗滌3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶4 000)，37 ℃孵育1 h，電化學發光(ECL)法顯色曝光。上述實驗重復3次用于結果分析[10]。

1.2.3雷帕霉素處理黑素化PM感染后Ana-1細胞的自噬水平檢測 將Ana-1細胞按2×105cells /cm2的密度在6孔細胞培養板中接種4組細胞：黑素化PM+雷帕霉素組(A組)、黑素化PM組(B組)、雷帕霉素組(C組)、空白對照組(D組)。Ana-1細胞培養過夜至貼壁后，A、C組加入雷帕霉素至50 nmol/L，細胞培養箱中孵育48 h，繼而于A、B組中按感染復數約為8分別加入黑素化PM懸液共孵育3 h，D組加入等體積RPMI-1640完全培養基作為空白對照。孵育結束后，按1.2.2中Western blot的實驗條件進行Ⅱ型微管相關蛋白1型輕鏈3(LC3Ⅱ)表達水平的檢測，實驗重復3次并分析結果。

1.2.4雷帕霉素處理后黑素化PM感染的Ana-1細胞LC3蛋白定位的觀察 將Ana-1細胞按1×105cells/cm2的密度在24孔細胞培養板中接種A、B、C、D、E共5組細胞。待Ana-1細胞培養過夜至貼壁后，A組與D組細胞分別加入雷帕霉素至50 nmol/L并于細胞培養箱中孵育48 h，之后于A、B組中按感染復數約為8分別加入黑素化PM懸液，C組細胞按相同感染復數加入常規PM懸液孵育3 h，E組加入等體積RPMI-1640完全培養基作為空白對照。孵育結束后以預冷的PBS洗去未被吞噬的菌體，采用10 g/L多聚甲醛固定細胞10 min，5 mL/L Triton X-100透膜20 min，正常山羊血清封閉20 min。免疫雜交時以兔源抗LC3多克隆抗體(1∶200)于37 ℃濕盒中孵育1 h，PBST洗滌3次后采用Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔 IgG(1∶500) 于37 ℃濕盒中孵育1 h。熒光倒置顯微鏡觀察并采集圖像[11]。

1.2.5雷帕霉素對黑素化PM直接殺滅效能的測定 取部分1.2.1中以RPMI-1640完全培養基混懸、菌液密度為1×107CFU/mL的黑素化PM懸液等分為3組。其中兩組加入雷帕霉素至50 nmol/L，并于細胞培養箱中分別孵育3、6 h；另一組加入等體積溶劑作為空白對照。之后將4組菌液分別離心、棄上清液，以無菌超純水重懸并梯度稀釋，接種于PDA培養基中37 ℃培養7 d并計數菌落，根據與對照組活菌數相比計算菌存活率。

1.2.6不同時間段雷帕霉素處理對Ana-1細胞殺滅黑素化PM效能影響的測定 Ana-1細胞按2×105cells/cm2的密度在6孔細胞培養板中接種6組細胞，培養過夜后其中3組分別加入50 nmol/L雷帕霉素并孵育48 h，繼而在各組中均按感染復數約為8分別加入黑素化PM懸液，37 ℃孵育0、3、6 h時分別取出1組含或不含雷帕霉素的細胞，轉移上清液。以無菌超純水充分裂解Ana-1細胞，將各組細胞裂解物與相應上清液混勻，全部平鋪于PDA培養基上37 ℃培養7 d并計數菌落，計算各組Ana-1細胞對黑素化PM的殺菌效率。

1.2.7不同濃度雷帕霉素對Ana-1細胞殺滅黑素化PM效能影響的測定 Ana-1細胞按2×105cells/cm2的密度在6孔細胞培養板中接種5組細胞，培養過夜后其中4組分別加入25、50、100及200 nmol/L雷帕霉素并孵育48 h，繼而在各組中均按感染復數約為8分別加入黑素化PM懸液，在37 ℃孵育3 h后分別吸取各組細胞的上清液。以無菌超純水充分裂解細胞，將各組細胞裂解物與相應上清液混勻，全部平鋪于PDA培養基上37 ℃培養7 d并計數菌落，計算各組Ana-1細胞對黑素化PM的殺菌效率。

2 結 果

2.1黑素化PM抑制Ana-1細胞的自噬活化 Western blot結果顯示，白假絲酵母與雷帕霉素刺激Ana-1細胞后LC3Ⅱ的表達水平較空白對照組明顯升高(均P<0.01)；而在相同感染復數的常規PM刺激下，Ana-1細胞的LC3Ⅱ表達水平較白假絲酵母組明顯降低(P=0.018)，并且黑素化PM組的Ana-1細胞LC3Ⅱ表達水平明顯低于常規PM組(P=0.005)，見圖1。

2.2雷帕霉素處理后黑素化PM感染的Ana-1細胞的自噬水平 無雷帕霉素預處理時Ana-1細胞吞噬黑素化PM后LC3Ⅱ表達水平與空白對照組比較無明顯差異(P=0.218)；而在雷帕霉素預處理后，吞噬黑素化PM的Ana-1細胞LC3Ⅱ表達水平明顯升高(P=0.009)，并且與雷帕霉素組比較無明顯差異(P=0.173)，見圖2。

1：雷帕霉素對照組；2：白假絲酵母對照組；3：黑素化PM組；4：常規PM組；5：空白對照組

圖1黑素化PM抑制Ana-1細胞LC3Ⅱ蛋白的表達

1：黑素化PM+雷帕霉素組；2：黑素化PM組；3：雷帕霉素組；4：空白對照組

圖2雷帕霉素處理后黑素化PM感染的Ana-1細胞LC3Ⅱ表達升高

2.3雷帕霉素引發黑素化PM與LC3蛋白的共定位 免疫熒光實驗顯示，空白對照組細胞綠色熒光均勻分布于細胞質內，而單純使用雷帕霉素處理后細胞質內出現大量的較為細小的綠色熒光斑點。吞噬了黑素化PM的Ana-1細胞LC3蛋白在細胞質內的分布較為均勻，而雷帕霉素預處理后自噬體膜標記蛋白LC3聚集為明亮的綠色斑點，顯示了自噬體的構建。與此同時，綠色斑點與黑素化PM具有明確的共定位關系，見圖3。

2.4雷帕霉素通過誘導巨噬細胞自噬殺傷黑素化PM 在50 nmol/L雷帕霉素、37 ℃共孵育3 h或6 h的條件下，黑素化PM與未經雷帕霉素處理組的菌存活率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4A。而Ana-1細胞與黑素化PM共孵育3 h (P=0.026)或6 h (P=0.014)后，雷帕霉素處理組的菌存活率較同時段無雷帕霉素處理組明顯降低(P<0.05)。與此同時，在與無雷帕霉素的Ana-1細胞共孵育0、3及6 h后，各組間黑素化PM的存活率明顯變化(P>0.05)，見圖4B。

2.5雷帕霉素誘導巨噬細胞自噬殺傷黑素化PM的劑量依賴性 為觀察不同濃度雷帕霉素對Ana-1細胞殺傷在黑素化PM效能的影響，采用25、50、100及200 nmol/L的雷帕霉素預處理Ana-1細胞孵育48 h。通過菌培養與菌落計數后發現，50、100及200 nmol/L雷帕霉素處理組黑素化PM的存活率明顯低于空白對照組(P<0.05)，相鄰濃度處理組之間黑素化PM的存活率相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，并且黑素化PM的存活率隨雷帕霉素濃度升高而降低，見圖5。

1：黑素化PM+雷帕霉素；2：黑素化PM組；3：常規PM組；4：雷帕霉素對照組；5：空白對照組；BF示明場，綠色熒光示LC3蛋白，Merge示明場與綠色熒光的組合

圖3雷帕霉素引發黑素化PM與LC3蛋白的共定位

A：雷帕霉素對黑素化PM直接抗菌效能的檢測；B：有無雷帕霉素預處理的Ana-1細胞對黑素化PM抗菌效能的檢測；*：P<0.05，與無雷帕霉素處理組比較

圖4雷帕霉素通過誘導Ana-1細胞自噬殺傷黑素化PM

1：空白對照組；2：25 nmol/L雷帕霉素處理組；3：50 nmol/L雷帕霉素處理組；4：100 nmol/L雷帕霉素處理組；5：200 nmol/L雷帕霉素處理組：*：P<0.05，與空白對照組比較；#：P<0.05，與25 nmol/L雷帕霉素處理組比較；△：P<0.05，與50 nmol/L雷帕霉素處理組比較；▽：P<0.05，與100 nmol/L雷帕霉素處理組比較

圖5雷帕霉素通過誘導Ana-1細胞自噬殺傷黑素化PM

3 討 論

近年來對細胞自噬機制愈加深入的研究揭示，自噬在應對多種病原生物的感染中扮演了重要角色，但目前對于自噬在抗真菌感染中機制的認識相對較少。白假絲酵母及克柔假絲酵母在感染巨噬細胞時后者的自噬水平顯著升高，而阻斷自噬體的構建則使巨噬細胞對二者的殺菌效能明顯降低[12-13]。在本研究中，筆者采用白假絲酵母菌作為陽性對照，首先觀察了吞噬常規及黑素化PM后巨噬細胞內自噬體標記蛋白LC3Ⅱ的表達水平。結果發現，常規PM對巨噬細胞系Ana-1細胞激活自噬的作用有限。有趣的是，吞噬了黑素化PM的Ana-1細胞自噬水平較空白對照組細胞無明顯差異，推測黑素對PM感染應激下的自噬激活具有抑制作用。筆者前期研究發現，煙曲霉感染時還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(NADPH oxidase，NOX)通過產生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)活化巨噬細胞自噬，而在PM的感染同樣會觸發巨噬細胞的呼吸爆發[14]。已知的是，在線粒體衰老泄露、多種病原體感染應激時ROS均可作為引發自噬體構建的上游調節分子[15]。根據黑素對ROS的消除作用，筆者推測PM可以通過分泌黑素干擾宿主細胞的自噬功能，但PM的其他毒力因子是否具有抑制自噬的作用有待進一步明確，后續筆者也將純化PM產生的黑素并探究黑素能否獨立影響巨噬細胞自噬[16-17]。

自噬作為古老的保守機制，多種病原體在與宿主細胞自噬的長久斗爭中進化出能逃逸甚至顛覆自噬的防御作用，而通過調節自噬提高殺傷效能成為治療此類病原體感染的策略之一，據此筆者探究了自噬誘導劑雷帕霉素在治療PM感染中的價值。值得注意的是，較高濃度的雷帕霉素可直接抑制多種致病真菌。但由于雷帕霉素的免疫抑制作用和毒性，患者難以耐受有效的藥物濃度而限制其應用價值。因此，筆者提出采用低濃度雷帕霉素通過激活自噬通路的策略對黑素化PM發揮抗菌效能。接受器官移植、大劑量糖皮質激素治療等免疫抑制患者是散播性真菌感染的主要好發人群。基于雷帕霉素的以上特性，該藥物對以上免疫抑制患者的抗真菌治療可能具有特殊優勢。通過Western blot與免疫熒光實驗，筆者發現雷帕霉素能有效提高吞噬黑素化PM的Ana-1細胞自噬水平，并且誘導的自噬體可包繞黑素化PM，為雷帕霉素激活的巨噬細胞自噬可降解黑素化PM提供了直接證據。

繼而，筆者測定了雷帕霉素對黑素化PM的抗菌效能。在本研究條件下，雷帕霉素對黑素化PM的生存率無明顯影響，并且Ana-1細胞與黑素化PM共孵育3或6 h后菌存活率也無明顯變化，表明低濃度雷帕霉素對黑素化PM無直接殺傷作用，并且Ana-1細胞在6 h以內也無抗菌作用。而以雷帕霉素預處理后，與Ana-1細胞共孵育的黑素化PM存活率明顯降低，并且與雷帕霉素濃度存在明顯的劑量依賴性。

綜上所述，黑素化PM可抑制巨噬細胞的自噬活化，而雷帕霉素可通過誘導自噬提高巨噬細胞對該菌的殺菌效能。后續，筆者將通過散播性黑素化PM感染的動物模型，進一步探究雷帕霉素在黑素化PM感染的治療價值與病理機制。

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