乳腺浸潤性導管癌中CDH1基因甲基化狀態及其臨床意義

楊 亮，迪力夏提·金斯汗，趙 倩，朱麗萍，吳 濤，李 丹，杜 露，王 波，王喜艷

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科一病區，烏魯木齊 830000)

乳腺癌的發生、發展是一個多因素及多階段復雜的過程，乳腺癌治療后復發、轉移是困擾臨床的難題。惡性腫瘤浸潤及轉移機制一直是腫瘤研究的熱點。細胞間黏附性下降是導致腫瘤轉移的因素之一。腫瘤細胞轉移首先是細胞黏附性改變，黏附分子介導的腫瘤細胞彼此之間的黏附力減少，出現上皮間葉性改變，腫瘤開始浸潤及轉移。CDH1基因是上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)的編碼基因，而E-cadherin是重要的黏附分子。CDH1基因的失活與多種腫瘤發生、發展密切相關。本研究對250例乳腺浸潤性導管癌組織標本中CDH1基因啟動子區域5′-CpG島的甲基化狀態進行檢測，探討CDH1基因啟動子甲基化在乳腺癌發生、發展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2011年1月本院收治的250例初診原發乳腺浸潤性導管癌患者，年齡 28～75歲，中位年齡48歲；其中絕經前患者147例，絕經后患者103例。納入標準：(1)病理確診為乳腺浸潤性導管癌患者(患者病理切片均由3位病理學專家進行病理會診)；(2)入院前無放、化療及內分泌治療史；(3)卡式功能狀態評分(KPS評分)≥80分，接受手術治療；(4)無其他系統惡性腫瘤病史；(5)乳腺癌患者手術前同意采集標本并簽署知情同意書。排除標準：排除乳腺浸潤性小葉癌及原位癌,術前行化療、放療或內分泌治療，排除乳腺癌轉移腫瘤及其他特殊類型乳腺腫瘤(家族性乳腺癌、肉瘤、微乳頭狀癌、淋巴瘤、妊娠期乳腺癌、炎性乳腺癌等)。本研究經過本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集 取患者乳腺癌組織、相應癌旁組織、淋巴結組織及正常乳腺組織。取基因組DNA，提取的DNA經紫外分光光度計定量后，-20 ℃保存備用。

1.2.2免疫組織化學法檢測E-cadherin 乳腺癌組織標本脫蠟、水化，按試劑說明書步驟采用免疫組織化學SP法染色，抗原修復采用微波法。E-cadherin染色結果的判斷標準：由3位病理專科醫師分別判定免疫組織化學染色結果；免疫組織化學染色的切片中隨機選取5個高倍視野(×400倍),計算鏡下陽性細胞百分比及著色程度。E-cadherin表達以半定量法判定：中等以上染色陽性細胞數0～<11%記為0 分，11%～<26%記為1分，26%～<51%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；評分≤2分為低表達或陰性組，評分≥3分為高表達或陽性組。

1.2.3基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾方法 使用亞硫酸氫鈉法進行DNA修飾并純化保存，按使用說明書操作(EpiTect Bisulfite，美國Qiagen公司)。取10 μg DNA加入3 mol/L NaOH裂解液5 μL，37 ℃變性，放置20 min，加入2 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL和0.2 mol/L氫醌30 μL，50 ℃水浴18 h。在1 mL DNA純化樹脂中加入處理的DNA樣品及8%異丙醇2 mL濾析，100%乙醇與3 mol/L醋酸鈉沉淀，離心，棄去上清液，干燥，加2 μL TE溶解液，-20 ℃保存備用。

1.2.4甲基特異性PCR分析 CDH1基因甲基化引物(CDH1-M)，MR：5′-TAA CTA AAA ATT CAC CTA CCG AC-3′，MF：5′-TTA GGT TAG AGG GTT ATC GCG T-3′，擴增片段長度112 bp。CDH1基因非甲基化引物(CDH1-U)，UF：5′-TAA TTT TAG GTT AGA GGG TTA TTG T-3′,UR：5′-CAC AAC CAA TCA ACA ACA CA-3′，擴增片段長度120 bp。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統觀察試驗結果：電泳中出現甲基化條帶且沒有非甲基化條帶判定為CDH1基因甲基化(M)；條帶中出現非甲基化條帶且沒有甲基化條帶判定為CDH1基因非甲基化(U)；同時出現甲基化和非甲基化條帶判定為半甲基化(UM)。在體外經過甲基轉移酶處理過的乳腺組織基因組DNA(美國NEB公司)作為陽性對照，未處理的健康人乳腺組織DNA作為陰性對照，使用蒸餾水作為空白對照。

2 結 果

2.1CDH1基因啟動子甲基化在散發性乳腺癌的發生率 250例患者乳腺癌組織標本共發現113例CDH1基因啟動子甲基化，甲基化率為45.20%；癌旁組織標本中有55例CDH1基因啟動子甲基化，甲基化率為22.0%；CDH1基因啟動子甲基化率在乳腺癌組織與癌旁組織中比較，差異有統計學意義(χ2=30.156，P<0.01)。見圖1、2。

M：Marker；A、B：CDH1基因啟動子甲基特異性PCR分析；1、2、4～9：CDH1基因啟動子甲基化條帶；3：CDH1基因啟動子未甲基化條帶；NC：陰性對照；PC：陽性對照

圖1 CDH1基因啟動子甲基化與非甲基化電泳圖

圖2 乳腺癌組織與癌旁組織CDH1基因啟動子甲基化情況比較

2.2E-cadherin蛋白在CDH1基因啟動子甲基化與非甲基化乳腺癌組織的表達 113例患者乳腺癌組織CDH1基因甲基化標本中E-cadhenrin高表達22例(19.47%)，低表達91例(80.53%)；137例患者乳腺癌組織CDH1基因非甲基化標本E-cadhenrin高表達65例(47.44%)，低表達72例(52.55%)；E-cadhenrin表達情況在乳腺癌組織CDH1基因甲基化與未甲基化標本中比較，差異有統計學意義(χ2=21.360，P<0.01)。見圖3、表1。

表1 乳腺癌組織CDH1基因啟動子甲基化與E-cadherin蛋白表達的關系

2.3E-cadherin在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達 在正常乳腺組織中E-cadherin主要分布在乳腺導管上皮和乳腺腺泡上皮。免疫組織化學法染色E-cadherin陽性為細胞膜呈棕黃色顆粒著色，E-cadherin在乳腺癌組織中多呈低表達(圖4A),而在癌旁組織中多為高表達(圖4B)。E-cadherin在浸潤性乳腺導管癌細胞細胞膜表達減弱(圖5B)，甚至缺失(圖5A)。在250例患者乳腺癌組織中E-cadherin高表達的比率為34.80%(87/250)，低表達的比率為 65.20%(163/250)，乳腺癌組織E-cadherin高表達與低表達在乳腺癌和癌旁組織存在差異，差異有統計學意義(χ2=19.435，P<0.01)。

圖3 CDH1基因啟動子甲基化與未甲基化乳腺癌組織中E-cadherin蛋白表達情況比較

A：E-cadherin在乳腺癌組織中低表達；B：E-cadherin在癌旁組織中高表達

圖4 E-cadherin在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(SP，×100)

A：E-cadherin不表達(-)；B：E-cadherin低表達(+)；C：E-cadherin高表達(++)；D：E-cadherin高表達(+++)

圖5乳腺浸潤性導管癌組織中免疫組織化學染色E-cadherin在病灶中表達(SP，×200)

2.4CDH1基因mRNA的表達情況 通過反轉錄定量PCR法檢測CDH1基因mRNA在原發性乳腺癌、淋巴結轉移乳腺癌和正常乳腺組織標本中的表達情況，見圖6。CDH1基因mRNA在乳腺癌組織CDH1基因啟動子甲基化標本中表達水平低(0.538±0.108)，在乳腺癌組織CDH1基因啟動子非甲基化標本中表達水平較高(0.734±0.072)，二者差異有統計學意義(t=16.99，P<0.01 )，見圖7A。CDH1基因mRNA的表達水平在乳腺癌淋巴結轉移組、淋巴結未轉移組及正常乳腺組織比較，差異有統計學意義(F=43.515，P<0.01)，見圖7B。

2.5乳腺浸潤性導管癌組織CDH1基因啟動子甲基化與患者病理臨床特征的關系 CDH1基因啟動子甲基化組和未甲基化組在淋巴結是否轉移、人表皮生長因子受體2(CerbB-2)表達、分子分型及腫瘤細胞組織學分級中差異有統計學意義(P<0.05)，而在民族、年齡、是否絕經、ER表達、腫塊直徑及Ki-67表達等因素中差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

E：CDH1基因mRNA(423 bp)；G：內部控制基因GAPDH(140 bp)；B：乳腺癌組織；NS：正常乳腺組織

圖6乳腺癌和正常乳腺組織中CDH1基因mRNA的表達

A：CDH1基因啟動子甲基化與未甲基化乳腺癌組織比較；B：乳腺癌淋巴結轉移、淋巴結未轉移及正常乳腺組織比較

圖7 不同組織CDH1基因mRNA表達水平比較

續表2 CDH1啟動子甲基化與乳腺癌患者臨床病理的關系

淋巴結轉移：腋下淋巴結、前哨淋巴結鏡下宏轉移，同時包括淋巴結微轉移，直徑<2.0 mm 的腫瘤轉移病灶、成簇腫瘤細胞及單個腫瘤細胞

2.5CDH1啟動子甲基化組和非甲基化組乳腺癌COX回歸生存分析 乳腺浸潤性導管癌CDH1啟動子甲基化和非甲基化組隨訪60個月， CDH1啟動子甲基化(n=113)和非甲基化(n=137)組COX回歸分析乳腺癌5年生存率存在差異，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖8。COX多因素回歸分析提示:淋巴結陽性、組織學分級高、CerbB-2陽性、三陰性分子分型、 CDH1基因啟動子甲基化患者乳腺癌死亡危險性高，見表3、4。

圖8 CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化生存分析

變量變量分類及賦值分組非甲基化=0,甲基化=1淋巴結情況無=0,1～3個=1,≥4個=2組織學分級Ⅰ級=1,Ⅱ級=2,Ⅲ級=3腋窩淋巴結轉移N0=0,N1=1,N2=2,N3=3CerbB-2陰性=0,陽性=1分子分型Luminal A=1,Luminal B=2,HER-2(+)=3,三陰性=4

表4 CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化患者生存曲線COX多因素回歸分析

3 討 論

乳腺癌的發病率逐漸增高，已成為女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。乳腺癌復發及轉移是導致死亡的主要原因[3],惡性腫瘤浸潤及轉移機制中首先是細胞黏附性改變，腫瘤細胞彼此之間的黏附力減少，腫瘤出現傾向浸潤及轉移。因此,細胞間黏附性改變是導致腫瘤轉移的重要因素之一。E-cadherin是鈣黏附家族中重要的一員,目前研究發現E-cadherin參與不同腫瘤的早期發生、浸潤及轉移[4-6]。其表達與多種腫瘤的浸潤轉移、臨床預后有密切聯系[7]。CDH1是E-cadherin蛋白編碼基因,是一種抑癌基因,抑癌基因甲基化是腫瘤發生、發展過程中基因表達沉默的主要機制，且在某些情況下是抑癌基因失活的惟一機制。在多種腫瘤組織中均有CDH1基因表達的下調,CDH1基因的表達下調除了受基因多態性、外顯子突變等因素影響外．其啟動子區域的5′-CpG島異常甲基化作用近年來被越來越多的研究者所關注[8-9]。

本研究對新疆地區250例患者乳腺癌組織標本CDH1基因甲基化進行了檢測,研究發現乳腺癌組織中CDH1基因甲基化和E-cadherin蛋白低表達相關(χ2=21.360，P<0.01),可能是引起E-cadherin蛋白低表達的主要因素。同時研究發現CDH1基因甲基化和淋巴結轉移相關，有局部淋巴結轉移的乳腺癌組織的甲基化表達率明顯高于無局部淋巴結轉移乳腺癌組織，二者之間差異有統計學意義(χ2=19.086，P<0.01)。推測CDH1基因甲基化抑制了E-cadherin蛋白表達,使E-cadherin不能發揮正常作用維持細胞形態及連接，導致細胞自腫瘤組織中脫落進而引起腫瘤的轉移，這說明 CDH1基因改變和乳腺癌轉移密切相關。當然，基因表達下調除甲基化外，還有其他的一些CDH1基因改變，如基因突變也是引起基因表達下調的原因之一。章海波等[10]在肺癌中研究發現，CDH1基因rs16260C>A遺傳變異可顯著增加非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLS)患者確診時為晚期并發生轉移的概率,CDH1基因rs16260C>A遺傳變異可促進NSCLS的進展[10]。因此，CDH1基因的甲基化也不能完全反映出E-cadherin的表達缺失程度。也有可能一部分腫瘤細胞的CDH1基因沒有甲基化而失活，這也可以解釋腫瘤組織中E-cadherin 蛋白表達的異質性。本研究提示:CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化乳腺癌患者5年生存率比較，差異有統計學意義(P<0.01) ，和部分研究基本一致[9]。當然乳腺癌預后和多種因素相關，CDH1啟動子甲基化改變是否與乳腺癌的不良預后有關仍需要大量的研究。本研究由于樣本量偏小，研究數據尚不能確切說明影響腫瘤預后，還需要進一步大樣本的研究。

CDH1基因甲基化的表觀遺傳學改變已經成為腫瘤研究中重要的分子之一[11-12]，目前，DNA 甲基化導致轉錄失活這一機制已基本明確，但乳腺癌中CDH1基因甲基化改變的原因及其調控機制尚不清楚。因此，需進一步積累更多的臨床資料、擴大樣本量進行深入研究。CDH1基因信號傳導通路及調控機制仍需要繼續深入研究。

[1]SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A．Cancer Statistics 2016[J]．CA Cancer J Clin，2016，66(1)：7-30．

[2]CHEN W，ZHENG R，BAADE P D，et al．Cancer Statistics in China,2015[J]．CA Cancer J Clin，2016，66(2)：115-132．

[3]田茗源，王林輝，張雄，等．肺癌組織中E-cadherin和Vimentin的表達及其與上皮-間質轉化的相關性[J]．中國生物制品學雜志，2011，24(9)：1068-1071．

[4]WENDT M K，TAYLOR M A，SCHIEMANN B J，et al．Down-regulation of epithelial cadherin is required to initiate metastatic outgrowth of breast cancer[J]．Mol Biol Cell，2011，22(14)：2423-2435．

[5]BODNAR L，STANCZAK A，CIERNIAK S，et al．Wnt/β-catenin pathway as a potential prognostic and predictive marker in patients with advanced ovarian cancer[J]．J Ovarian Res，2014，7：16．

[6]KABBAGE M，TRIMECHE M，BEN NASR H，et al．Expression of the molecular chaperone αB-crystallin in infiltrating ductal breast carcinomas and the significance thereof:an immunohistochemical and proteomics-based strategy[J]．Tumor Biol，2012，33(6)：2279-2288．

[7]LI Y，TANG Y，ZHOU R，et al．Genetic polymorphism in the 3′-untranslated region of the E-cadherin gene is associated with risk of different cancers[J]．Mol Carcinog，2011，50(11)：857-862．

[8]NAGHITORABI M，MOHAMMADI-ASL J，SADEGHI H M M，et al．Quantitation of CDH1 promoter methylation in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of breast cancer patients using differential high resolution melting analysis[J]． Adv Biomed Res，2016，5：91．

[9]LIU J，SUN X，QIN S，et al．CDH1 promoter methylation correlates with decreased gene expression and poor prognosis in patients with breast cancer[J]．Oncol Lett，2016，11(4)：2635-2643．

[10]章海波，馬慶榮，李智佳，等．鈣粘蛋白E基因的基因多態性與非小細胞肺癌進展的相關性研究[J]．中國現代醫學雜志，2014，24(13)：18-22．

[11]KIM S A，INAMURA K，YAMAUCHI M，et al．Loss of CDH1 (E-cadherin) expression is associated with infiltrative tumour growth and lymph node metastasis[J]．Br J Cancer，2016，114(2)：199-206．

[12]CORSO G，INTRA M，TRENTIN C，et al．CDH1 germline mutations and hereditary lobular breast cancer[J]．Fam Cancer，2016，15(2)：215-219．