豬輪狀病毒VP融合蛋白的構建及其免疫原性研究

姚 帥，徐進平

(武漢大學生命科學學院，病毒學國家重點實驗室，湖北武漢 430072)

豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PRV)是一種能引起仔豬厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征性癥狀的疾病的RNA病毒[1-3]。PRV外衣殼由結構蛋白VP4和VP7組成[4]，其中VP7由基因片段(9或7、8，依不同毒株而異)編碼，分子量為37 kD，由326個氨基酸組成，占病毒蛋白總量的30%，為病毒外膜的重要糖蛋白和主要中和抗原，并決定病毒的G血清型，且在相同血清型的不同毒株之間高度保守[5]。研究表明，重組蛋白和VP7的合成肽(275～295位氨基酸)可產生保護動物避免PRV感染的中和抗體[6-7]。VP4是由基因片段4編碼，由776個氨基酸組成的分子量為88 kD的病毒多肽，占病毒蛋白總量的1.5%。VP4與病毒毒性有關，使病毒具有致病性[8]。VP8屬于VP4截斷片段，含有247個氨基酸，VP8包含了VP4的主要抗原位點，且負責VP4特異性中和反應。其同全長的VP4片段一樣，能刺激機體產生中和抗體，從而激發免疫保護作用[9-11]。

目前，有很多關于以VP8、VP7蛋白為基礎研制口服疫苗研究的報道，但在通過口服方式免疫動物時，由于各種消化酶作用以及本身大分子性質，往往達不到很好的免疫效果[12]。該研究將VP8與VP7基因共同表達，并借助一蛋白轉導結構域：TAT轉導肽序列[13-15]，將其連接至VP8-VP7基因3′端，構建了融合蛋白VP8-VP7-TAT。通過檢測融合蛋白VP8-VP7-TAT以不同給藥方式免疫小鼠產生的免疫效果；同單一VP8-TAT、VP7-TAT相比融合蛋白VP8-VP7-TAT的免疫原性；融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸功能；融合蛋白VP8-VP7-TAT免疫動物的安全性，為PRV口服疫苗的研究提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒。大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)購自Novagen公司，質粒pGEX-6p-1為病毒學國家重點實驗室保存。

1.1.2試劑。質粒小提取試劑盒和ELISA試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，GST-Resin純化試劑盒購自七海生物，HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗鼠IgA購自武漢三鷹生物技術有限公司，抗GST血清為病毒學國家重點實驗室保存。

1.1.3實驗動物。SPF級別6～8周齡的雄性昆明小鼠購自湖北省疾控中心的實驗動物研究中心。

1.2方法

1.2.1基因合成與鑒定。參照JL94株VP8基因序列(AY523636.1)與VP7基因序列(AER25320.1)，在融合基因VP8-VP7的C端連接TAT轉導肽序列，并將重組基因VP8-VP7-TAT克隆至表達載體pGEX- 6p-1中。用pGEX -6p-1通用引物(上游引物F：5′-GGGCTGGCAAGCCACG TTTGGTG-3′；下游引物R：5′-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3′)擴增VP8-VP7-TAT基因，經菌落PCR、基因測序鑒定重組質粒為pGEX-VP8-VP7-TAT。以重組質粒pGEX-VP8-VP7-TAT為模板，設計引物(VP8-up：CCGGAATTCATGGCTTCGCTCATTTATAGACV，VP8-down：CCGCTCGAGCTAACGACGACGCTGACGACGTTTCTTACGGCCATAAGCTCTTGTGT G/VP7-up：CCGGAATTCCCAACAACTGCACCACAAAC，VP7-down：CCGCTCGAGCTAACGACGACGCTGACGA)，構建了重組質粒pGEX-VP8-TAT、pGEX-VP7-TAT。

1.2.2重組工程菌的制備。將實驗室保存的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)接種于LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600為0.6左右。取1.5 mL菌液離心，棄上清，加入200 μL預冷的0.1 mol/L氯化鈣輕輕搖動重懸菌體沉淀，冰浴30 min。4 ℃、4 000 r/min離心10 min后棄上清，加入100 μL預冷的0.1 mol/L氯化鈣重懸菌體，得到制備好的E.coliBL21(DE3)感受態細胞。取1 μL重組質粒轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，將轉化產物均勻涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜，經菌液PCR鑒定陽性重組子。即構建基因工程菌E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)、E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-TAT)及E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP7-TAT)。

1.2.3融合蛋白的表達與純化。挑取基因工程菌的單菌落接種于5 mL加有200 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃過夜培養后，按1∶100的比例轉接到20 mL選擇性LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600約為0.6時，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導劑，30 ℃、250 r/min振蕩培養4 h。將菌液在4 ℃、10 000 r/min離心1 min，收集菌體沉淀，加入細胞裂解液重懸菌體，300 W超聲破碎至菌液不再黏稠后，取少量樣品加入適當上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳分離和Western blot分析；12 000 r/min離心10 min，收集包涵體沉淀。經洗滌液洗滌及變、復性后，將溶有融合蛋白的溶液與GST純化柱在4 ℃孵育過夜，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。緩慢去除上清液，加入PBS清洗雜蛋白，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。緩慢去除上清液后，加入pH 8.0 Elution buffer，室溫輕搖10 min，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況。

1.2.4實驗動物分組、免疫和采樣。將昆明小鼠隨機分為8組，每組8只。融合蛋白VP8-VP7-TAT、VP8-TAT以及VP7-TAT分別經腹腔注射和灌胃的方式免疫小鼠，免疫劑量為100 μg/只，免疫3次，間隔14 d以相同劑量加強免疫1次，同時設置腹腔注射或灌胃PBS作為陰性對照組。在首次免疫后的第7、21、35天收集免疫小鼠血液和糞便樣品：全血37 ℃靜置1 h后，在4 ℃放置過夜，次日4 ℃、2 000 r/min離心20 min，分離血清；每0.1 g糞便用200 μL 0.01 mol/L的PBS充分混勻，4 ℃作用1.5 h，離心收集上層液體。

1.2.5抗體檢測。分別將純化的融合蛋白VP8-VP7-TAT、VP8-TAT和VP7-TAT以100 μL/孔包被酶標板，4 ℃放置過夜；次日棄去孔中液體，PBST反復洗滌5次，按200 μL/孔加入5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h；棄去孔中液體，PBST洗滌5次，按100 μL/孔加入適當倍數稀釋好的待檢樣品，37 ℃孵育2 h；棄去孔中液體，PBST洗滌5次，按100 μL/孔加入1∶5 000稀釋的二抗(HRP標記羊抗鼠IgG抗體或HRP標記羊抗鼠IgA抗體)，37 ℃孵育2 h；棄去孔中液體，PBST洗滌5次，每孔加入100 μL OPD底物溶液，避光顯色5 min后加入反應終止液，測定樣品的OD490。

1.2.6遲發型超敏反應。將融合蛋白VP8-VP7-TAT與氟氏完全佐劑1∶1反復吹打充分混勻后注射于小鼠的右后足墊皮下，注射量為10 μg/只，并在同一小鼠的左后足墊皮下注射同體積生理鹽水作為對照。注射抗原后測量24、48、72 h以及7、14 d小鼠的左右足墊厚度，觀察腫脹的發生和消長情況，其結果以++、+、-表示(++代表明顯腫脹；+代表輕度腫脹；-代表無腫脹)。

1.2.7融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸活性檢測。取5 cm小鼠腸管，用PBS緩沖液沖洗小鼠腸管，腸管一端扎緊，吸取濃度為100 μg/mL的溶有融合蛋白VP8-VP7-TAT溶液至扎好的小鼠腸管，扎好腸管的另一端，投入到裝有10 mL PBS緩沖液的試管中，并使PBS緩沖液完全浸沒小鼠腸管，設置PBS陰性對照組，30 ℃下靜置，間隔1 h取樣，ELISA方法檢測待檢樣品。

1.2.8小鼠安全性實驗。通過監測小鼠體重的變化來進行關于融合蛋白VBP8-VP7-TAT的小鼠安全性實驗。分別在0、14、28、42 d稱量腹腔注射組、灌胃組、PBS對照組小鼠的平均體重，觀察融合蛋白VP8-VP7-TAT對小鼠生理指標的影響。

2 結果與分析

2.1重組質粒的鑒定以重組質粒pGEX-VP8-VP7-TAT為模板，用引物擴增VP8-VP7-TAT序列，PCR鑒定重組質粒，結果顯示目的條帶與預期大小1 069 bp相符。經后續測序鑒定，重組質粒pGEX-VP8-VP7-TAT構建正確(圖1)。

注：M.DNA Marker IV；1.重組質粒pGEX-VP8-VP7-TAT的PCR擴增產物Note：M.DNA Marker IV；1.Recombinant plasmid pGEX-VP8-VP7-TAT PCR amplification product圖1 重組質粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid

2.2基因工程菌的誘導表達將基因工程菌E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)振蕩培養至OD600約為0.6時，以0.5 mmol/L IPTG、37 ℃誘導表達4 h。結果顯示，誘導后基因工程菌E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)表達的蛋白分子量約59.9 kD，與預期的融合蛋白大小相符。初步表明融合蛋白VP8-VP7-TAT在大腸桿菌中獲得表達(圖2)。

注：M.蛋白Marker；1.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)破碎液沉淀；2.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)破碎液上清；3.未誘導E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液沉淀；4.未誘導E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液上清；5.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液沉淀；6.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液上清Note：M.Protein Marker；1.Crushing liquid precipitation of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)；2.Crushing liquid supernatant of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)；3.Crushing liquid precipitation of non-induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)；4.Crushing liquid supernatant of non-induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)；5.Crushing liquid precipitation of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)；6.Crushing liquid supernatant of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)圖2 融合蛋白VP8-VP7-TAT的誘導表達分析Fig.2 Expression analysis of fusion protein VP8-VP7-TAT

2.3融合蛋白VP8-VP7-TAT的Westernblot分析將基因工程菌E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)誘導后進行SDS-PAGE電泳。之后將蛋白轉移到NC膜上，觀察Western blot結果。結果顯示，表達的與GST融合的蛋白能被抗GST的單克隆抗體識別，蛋白條帶大小與預期59.9 kD符合，證實融合蛋白VP8-VP7-TAT在大腸桿菌中得以正確表達(圖3)。

2.4融合蛋白的純化收集誘導后E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)、E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-TAT)、E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP7-TAT)破碎液沉淀，經尿素洗滌、過濾后，將其與GST純化柱4 ℃過夜孵育后，用適量PBS洗去雜蛋白，最后用pH 8.0的還原性谷胱甘肽洗脫液洗脫目的蛋白，從而獲得純化蛋白(圖4)。

注：M.蛋白Marker；1.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液沉淀；2.誘導后E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)破碎液上清Note：Protein Marker；1.Crushing liquid precipitation of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)；2.Crushing liquid supernatant of induced E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)圖3 融合蛋白VP8-VP7-TAT的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of fusion protein VP8-VP7-TAT

注：M.蛋白Marker；1～3.純化蛋白VP8-VP7-TAT；4～6.純化蛋白VP8-TAT；7～9.純化蛋白VP7-TATNote：M.Protein Marker；1-3.Purified protein VP8-VP7-TAT；4-6.Purified protein VP8-TAT；7-9.Purified protein VP7-TAT圖4 融合蛋白的純化Fig.4 Purification of fusion protein

2.5免疫小鼠的血清IgG抗體水平融合蛋白VP8-VP7-TAT，以及按照VP8-VP7-TAT制備方法制備的融合蛋白VP8-TAT、VP7-TAT，經腹腔注射和灌胃給藥方式免疫昆明小鼠，免疫3次，間隔14 d。于免疫后7、21、35 d隨機取3只實驗小鼠斷尾取血，分離血清。血清IgG抗體ELISA檢測結果顯示(圖5)：在免疫7 d后，腹腔注射組和灌胃組小鼠血清特異性IgG抗體OD490相比于陰性對照組均有顯著升高，可見腹腔注射組和灌胃組小鼠在免疫后第7天就產生了特異性IgG抗體。在經過二免、三免后，腹腔注射組和灌胃組小鼠血清中抗體的OD490均持續升高，與陰性對照組相比差異顯著，而陰性對照組的OD490變化不大。在整個實驗過程中，腹腔注射組的血清特異性抗體IgG的OD490始終高于灌胃組，且融合蛋白VP8-VP7-TAT的OD490一直高于VP8-TAT、VP7-TAT，而陰性對照組一直變化不大且維持在低水平。

注：A.腹腔注射組小鼠血清IgG抗體的間接ELISA檢測；B.灌胃組小鼠血清IgG抗體的間接ELISA檢測Note：A.Indirect ELISA detection of serum IgG antibody in the intraperitoneal injection group；B.Indirect ELISA detection of serum IgG antibody in the gavage group圖5 免疫小鼠血清IgG抗體的間接ELISA檢測Fig.5 Indirect ELISA analysis of IgG antibody in murine serum

2.6免疫小鼠的黏膜IgA抗體水平融合蛋白VP8-VP7-TAT，以及按照VP8-VP7-TAT制備方法制備的融合蛋白VP8-TAT、VP7-TAT，經腹腔注射和灌胃給藥方式免疫昆明小鼠，間隔7 d隨機取3只實驗小鼠的糞便樣品，間接ELISA檢測腸道黏膜IgA抗體。檢測結果顯示(圖6)：在免疫7 d后，灌胃組小鼠特異性抗體IgA的OD490相比于陰性對照組有了顯著升高，而腹腔注射組小鼠特異性抗體IgA的OD490相比于陰性對照組升高不顯著。在經過二免、三免后，灌胃組小鼠IgA抗體的OD490均持續升高，與陰性對照組相比差異顯著，而腹腔注射組和陰性對照組的OD490變化不大。在整個實驗過程中，灌胃組的特異性抗體IgA的OD490始終高于腹腔注射組，且融合蛋白VP8-VP7-TAT組特異性抗體IgA的OD490始終高于VP8-TAT組和VP7-TAT組，而陰性對照組的OD490則一直維持在低水平。

注：A.腹腔注射組小鼠黏膜IgA抗體的間接ELISA檢測；B.灌胃組小鼠黏膜IgA抗體的間接ELISA檢測Note：A.Indirect ELISA detection of mucosa IgA antibody in the intraperitoneal injection group；B.Indirect ELISA detection of mucosa IgA antibody in the gavage group圖6 免疫小鼠黏膜IgA抗體的間接ELISA檢測 Fig.6 Indirect ELISA analysis of IgA antibody in murine intestinal mucosa

2.7融合蛋白的安全性實驗通過監測小鼠體重的變化來進行關于融合蛋白VBP8-VP7-TAT的小鼠安全性實驗。分別在0、14、28、42 d稱量腹腔注射組、灌胃組、PBS對照組小鼠的平均體重，觀察融合蛋白VP8-VP7-TAT對小鼠生理指標的影響。結果顯示：3組小鼠的體重沒有顯著差異，說明融合蛋白VP8-VP7-TAT不影響小鼠的生長指標，為安全可靠的免疫抗原(圖7)。

圖7 免疫小鼠的體重變化Fig.7 The change of body weight in murine

2.8融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸活性取小鼠腸管來研究融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸功能，檢測腸管外環境中融合蛋白VP8-VP7-TAT的吸光值。結果顯示(圖8)：VP8-VP7-TAT樣品組檢測腸外溶液中融合蛋白VP8-VP7-TAT的OD490在4 h期間保持持續上升，在4 h時，融合蛋白VP8-VP7-TAT的OD490達到最大值，5 h開始下降。根據PBS陰性對照所測得的OD490計算得出的cut-off值為0.15，VP8-VP7-TAT樣品組腸外溶液的OD490在2～5 h內均高于0.15，呈陽性結果。可見TAT蛋白轉導肽能夠攜帶與其融合表達的VP8-VP7蛋白穿過小鼠腸壁細胞進入到腸壁外溶液中，并且一段時間內，腸壁外溶液中融合蛋白VP8-VP7-TAT的濃度水平隨著時間延長而升高。實驗結果表明融合蛋白VP8-VP7-TAT具有穿腸活性。

圖8 融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸活性檢測Fig.8 The intestinal activity of fusion protein VP8-VP7-TAT

2.9遲發型超敏反應實驗動物對抗原的遲發型超敏反應可通過足墊腫脹實驗來觀察。結果表明(表1)：同注射生理鹽水的對照組相比，三免之后的小鼠足墊注射抗原24 h后出現明顯的足墊腫脹，在48、72 h時達到高峰，7～14 d腫脹逐漸消退。而同一昆明小鼠的左后足墊注射生理鹽水后未見足墊腫脹反應。

表1 免疫小鼠足墊腫脹程度

3 討論

豬輪狀病毒是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病原之一，給豬養殖業造成了巨大的經濟損失。VP8和VP7基因作為PRV誘導免疫中和反應的核心序列，利用其翻譯的蛋白制作亞單位疫苗具有良好的可行性。然而，PRV主要攻擊宿主的腸道組織，腸道黏膜免疫所產生的分泌型IgA抗體才是抵抗該病毒的有效抗體，因此口服免疫作為一種簡單可行的免疫接種途徑，既能誘導產生分泌型IgA抗體，又具有可以應用于規模養豬的優勢。

該研究基于VP8、VP7基因的誘導中和抗體作用及TAT轉導肽的跨膜轉導特性，首次將VP8、VP7與TAT轉導肽進行融合，成功構建了重組質粒pGEX-VP8-VP7-TAT并表達與純化了融合蛋白VP8-VP7-TAT。為了研究融合蛋白VP8-VP7-TAT經口服和注射小鼠后體內的免疫應答方式，以及同單一VP8-TAT、VP7-TAT相比免疫原性是否有所增強，該研究比較了2種不同給藥方式以及同單一VP8-TAT、VP7-TAT相比誘導產生的抗體水平。結果顯示，腹腔注射組能夠誘導產生較高水平的血清IgG抗體，產生速度較快，但其黏膜IgA抗體一直處于較低水平；而灌胃組除了可以誘導小鼠產生中等水平的血清IgG抗體之外，其黏膜IgA抗體水平也是顯著高于其他實驗組；融合蛋白重構體VP8-VP7-TAT無論以腹腔注射還是以灌胃的方式免疫小鼠，其誘導產生的血清IgG抗體和黏膜IgA抗體水平均高于單一的VP8-TAT、VP7-TAT。以上結果說明融合蛋白VP8-VP7-TAT經口服或注射小鼠后，能夠有效誘導小鼠機體產生體液免疫應答，并且融合蛋白VP8-VP7-TAT經口服可誘導小鼠機體產生較強的黏膜免疫應答，并且相比于傳統的單一VP8或者VP7作為免疫原能刺激機體產生更強的免疫應答。此外，融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿腸實驗和小鼠安全性實驗表明，融合蛋白VP8-VP7-TAT具有穿腸活性且不影響免疫動物的生長指標，為安全可靠的免疫抗原，為口服抗PRV基因工程疫苗的研制提供一定的參考價值。

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