創傷弧菌快速檢測法的建立

徐 宸，王 鑫，鐘 江

(1.復旦大學生命科學學院，上海 200433；2.默克化工技術(上海)有限公司，上海 201203)

創傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種革蘭氏陰性桿菌，是廣泛存在于海洋和鹽湖中的嗜鹽病原菌。它是一種重要的水產品污染病原，可造成養殖水產品的病害。同時也是一種致命的人類機會致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關[1]。創傷弧菌感染最致命的后果是原發性敗血癥，其死亡率在免疫功能低下的人群中可達50%以上[2]。由于創傷弧菌感染的高死亡率，創傷弧菌污染嚴重地區海鮮食品(尤其是生蠔)的安全問題是常見的。創傷弧菌的感染不僅給水產養殖業帶來經濟損失，而且也對人類健康造成危害。我國水產品品種豐富多樣，每年因食用水產品而引起食物中毒、急性胃腸炎或腹瀉等疾病屢有報道。因此，建立創傷弧菌的快速檢測方法顯得尤為非常重要。

傳統的創傷弧菌的檢測方法基于生理生化鑒定，由于弧菌屬主要病原表型相似性較高，給鑒別工作帶來較大困難，且鑒定過程費力耗時，不利于病原的確定和采取應對措施。 PCR和實時定量PCR(qPCR)技術被用來檢測創傷弧菌[3-4]。然而，使用PCR和定量PCR需要昂貴的熱循環儀，阻礙了這種方法的廣泛應用。靈敏度更高的環介導等溫PCR技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)也被用于檢測創傷弧菌，但該方法在現場操作過程中受環境影響較大，容易造成假陽性[5]。幾種免疫分析方法，包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫層析試紙條也被應用于創傷弧菌的鑒定，檢測試紙的靈敏度可達2×106CFU/mL。Li等[6]報道了采用改良斑點雜交技術檢測哈維氏弧菌，靈敏度可達2×105CFU/mL，且整個操作時間由8 h縮短至2 h。筆者探索了將此改良方法用于創傷弧菌的檢測，以期為創傷弧菌快速準確檢測方法的建立提供參考。

1.2材料

1.2.1菌株及試驗動物。創傷弧菌標準株ATCC 27562、溶藻弧菌(V.alginolyticus)標準株ATCC17749購自美國菌種保藏中心(ATCC)，陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)CMCC43501購自中國醫學微生物菌種保藏管理中心。創傷弧菌FD-1、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)由復旦大學生命科學學院A301-8實驗室保存。Sp2/0-Ag14(Sp2/0)小鼠骨髓瘤細胞株由復旦大學生命科學學院A301-8實驗室凍存。6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購于上海杰思捷公司。

1.2.2試劑及儀器。化學發光試劑ECL和TMB底物購自上海紀寧實業有限公司。硝酸纖維素膜(NC膜)和聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)購自美國Millipore。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP和BSA購自北京索萊寶科技有限公司。封閉劑PBSTB為2%(W/V)BSA溶解在PBST溶液中；封閉劑PBSTM為5%脫脂奶粉充分溶解在PBST溶液中，以上2種溶液4 ℃保存備用。

1.3方法

1.3.1抗創傷弧菌單克隆抗體的制備。將創傷弧菌FD-1用TCBS培養基活化，標準株ATCC27562為對照，培養后2株均呈現黃色特征性菌落。通過16 s rDNA 測序后Blast比對FQ-1與創傷弧菌標準株ATCC27562的同源度達99%。將創傷弧菌FQ-1擴大培養，保存備用。測得菌液濃度約為1×1010CFU/mL，細菌用0.3%的甲醛滅活24 h，滅活后菌液經細菌檢驗平板不再長菌。滅活后的菌液于4 ℃保存備用。以滅活創傷弧菌菌體制備單克隆抗體，參照李強等[7]方法免疫BALB/c小鼠。篩選融合細胞采用新鮮培養的創傷弧菌FQ-1。經亞克隆化篩選后獲得可穩定產生抗創傷弧菌抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞密度調至2×106個/mL，以每只0.5 mL的量注入8周齡BALB /c小鼠腹腔內，形成腹水后，以間接 ELISA 法檢測腹水效價。采用Protein A親和層析法對單克隆抗體進行純化，以紫外光分光光度計測量純化抗體濃度，將單抗溶液稀釋50倍，分別于260 nm和280 nm 波長測吸光度，于-20 ℃保存備用。

1.3.2改良斑點雜交法。

1.3.2.1斑點雜交條件優化。根據文獻[5]首先對封閉試劑、雜交膜以及封閉時間3個條件進行優化。將NC和 PVDF膜剪成邊長為1 cm的正方形。將不同封閉劑PBSTB和PBSTM分別以每孔1 mL加入浸沒膜塊，于37 ℃培養箱中孵育10、20、40 min，依次取出并以PBST將膜徹底沖洗干凈。將封閉后的膜塊放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗溶液中孵育90 min后取出并用PBST沖洗3次，最后用150 mL TMB顯色液將膜浸潤并孵育10 min。

1.3.2.2改良斑點雜交法特異性檢測。分別將創傷弧菌FD-1、創傷弧菌(ATCC27562)、溶藻弧菌(ATCC17749)、哈維氏弧菌、副溶血弧菌置于TAB培養基(2.5%NaCl)于30 ℃過夜培養，將菌懸液稀釋成1×108CFU/mL，以空白TAB培養基(2.5%NaCl)為對照；取5 mL 5種菌懸液加入膜中間并在60 ℃烘烤20 min使其固定在膜上；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的封閉劑中，37 ℃封閉25 min；接著將封閉后的膜放入抗創傷弧菌單克隆抗體的稀釋液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST將膜徹底沖洗干凈后放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗稀釋液中，同樣在37 ℃孵育90 min；最后將膜取出徹底洗盡殘留二抗并用濾紙吸干殘留的水分，將膜置于化學發光檢測儀中，同時加入ECL顯色液將膜浸潤并在不同曝光時間下進行拍照。

1.3.2.3改良斑點雜交法靈敏度檢測。將創傷弧菌懸液稀釋成1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL共4種濃度，并以稀釋液PBS作為空白對照。隨后，分別取5 mL不同濃度的菌懸液點于膜中央并置于60 ℃烘烤20 min將其固定在膜上；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的封閉劑中，37 ℃封閉25 min；接著將封閉后的膜放入抗創傷弧菌單克隆抗體的稀釋液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST將膜徹底沖洗干凈后放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗稀釋液中，同樣在37 ℃孵育90 min；最后將膜取出徹底洗盡殘留二抗并用濾紙吸干殘留的水分，將膜置于化學發光檢測儀中，同時加入ECL顯色液將膜浸潤并在不同曝光時間下進行拍照。

2 結果與分析

2.1抗創傷弧菌單克隆抗體的制備以甲醛滅活的創傷弧菌作為抗原免疫小鼠后，以其他水體常見弧菌屬和非弧菌屬菌株作為檢測抗原用于雜交瘤細胞的交叉反應試驗。篩選到一株特異性分泌抗創傷弧菌抗體的雜交瘤細胞株3A8，對其產生單克隆亞型進行分型定量檢測發現，IgG1亞型的豐度為66.5%，其余依次為Kappa亞型(22.3%)、 IgM亞型(2.7%)。因此，檢測表明該抗體屬于IgG1亞型，且效價在60 000以上，SDS-PAGE顯示抗體分子量為55 kD(圖1)，為斑點雜交法提供了原材料。

注：1為蛋白G結合后的上清樣品；2為硫酸氨抽提的腹水樣品；3、4為純化的抗體樣品；M為蛋白分子量標簽Note:1.Supernatant flowing through protein G；2.Extracted solution of ascite by (NH4)2SO4；3，4.Purified antibody；M.Marker圖1 創傷弧菌單克隆抗體純化SDS-PAGE結果Fig.1 SDS-PAGE of the purified V. vulnificus antibody

2.2改良斑點雜交法靈敏度根據文獻[6]采用Western blot化學發光試劑(ECL)代替TMB顯色劑。由圖2可知，改良ECL斑點雜交法對創傷弧菌的最低檢測限為1×105CFU/mL，而間接ELISA最低檢測限為1×107CFU/mL，與之前報道的檢測結果一致[6]。與傳統斑點雜交法及間接ELISA法相比，改良后的ECL介導的斑點雜交法具有更高的靈敏度，較傳統的斑點雜交法的靈敏度高100倍；與間接ELISA法在單菌落(CFU)水平上相比，改良后的ECL介導的斑點雜交法靈敏度較其高1 000倍。

注：創傷弧菌菌液梯度稀釋并固定至硝酸纖維素膜上(5 μL/孔)，以創傷弧菌單克隆抗體作為一抗，分別以化學發光試劑ECL和TMB作為顯色劑。第1行為ECL顯色劑：a～e.分別為1×109 ～1×105 CFU/mL 10倍梯度稀釋創傷弧菌菌液；f為空白對照。第2行為TMB顯色劑：a～f.分別為1×109 ～1×104 CFU/mL 10倍梯度稀釋創傷弧菌菌液；g為空白對照。第3行：ELISA分別包被從，加入1∶4 000比例稀釋的創傷弧菌單克隆抗體作為一抗，a～g.分別為1×108 ～1×102 CFU/mL 10倍梯度稀釋創傷弧菌菌液(100 μL/孔)，h為空白對照 Note:Sensitivity of V. vulnificus serial dilutions were spotted onto the NCM (5 μL/spot) and conducted dot blot using MAb as the primary antibody. Chemiluminescent reagents ECL and TMB were used as colorants respectively.Row 1，ECL as a colorant:a.1×109 CFU/mL，b.1×108 CFU/mL，c.1×107 CFU/mL，d.1×106 CFU/mL，e.1×105 CFU/mL，f.blank. Row 2，TMB as a colorant:a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.blank. Row 3: The ELISA plate was coated with serial dilutions (from 1×108 to 1×102 CFU/mL，100 μL/spot) of V. harveyi，and 1∶4 000 dilutions of MAb was used as the primary antibody. a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.1×102 CFU/mL， h.blank圖2 幾種創傷弧菌單克隆抗體檢測法靈敏度比較Fig.2 Comparison of the sensitivity of the detection methods of monoclonal antibodies in V. vulnificus

2.3改良斑點雜交法特異性以創傷弧菌標準菌株ATCC 27562為陽性對照考察了該方法的特異性，并考察是否與水體常見細菌存在交叉反應，檢測結果如圖3所示，結果表明除與創傷弧菌FD-1株外，與哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌ATCC17749、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌CMCC43501均無交叉反應。當抗原包被濃度分別為1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL時，均可檢出創傷弧菌，證明該方法可以用于創傷弧菌的檢測。

3 討論

創傷弧菌是廣泛分布在世界沿海和河口的病原菌，可感染多種水生動物，導致養殖行業的重大經濟損失。因此，對于創傷弧菌的檢測顯得尤為重要。目前已報道的創傷弧菌的檢測方法主要有PCR檢測、LAMP以及膠體金免疫層析試紙條法。PCR法雖然能夠較快檢測出創傷弧菌[8]，但需要特殊的設備和一定的技能，無法在基層養殖單位進行現場檢測，而LAMP法雖然不需要特殊設備，但對操作環境要求較高，且易產生假陽性。膠體金免疫層析試紙條雖然操作簡便，但靈敏度最高只能達1×105CFU/mL，無法用于病害的日常監測。

注：a～e.分別為細菌濃度為1×108 ～ 1×105 CFU/mL 10倍梯度稀釋菌液固定的樣品；f為空白對照Note：a～e.Bacterial concentration with 10-fold dilution: 1×108 ～ 1×105 CFU/mL；f. Blank圖3 創傷弧菌改良斑點雜交法靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity detection of the modified speckle hybridization method of V. vulnificus

該研究基于傳統斑點雜交技術，以靈敏性更好的ECL替代TMB底物顯色液，實現了創傷弧菌高靈敏度檢測，與之前報道的傳統斑點雜交法相比靈敏度提高了100倍，比ELISA法提高了1 000倍，而且反應時間大幅度縮短，孵育時間從8 h縮短至2 h，可以用于創傷弧菌的現場快速檢測。

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