組培檸檬桉葉綠素和揮發油研究

谷 瑤，周麗珠，李桂珍，韋穎文，楊 漓，溫如斯

(1.廣西壯族自治區林業科學研究院,廣西南寧 530002;2.北京林業大學經濟管理學院,北京 100083)

檸檬桉(EucalyptuscitriodoraHook)是桃金娘科(Myrtaceae)傘房屬(Corymbia)樹種，原產地澳大利亞，我國引種已有近百年歷史，在我國海南、福建、廣東、廣西均有栽培，鮮葉含揮發油0.80%～2.12%[1]，主要成分有香茅醛、新異胡薄荷醇、異胡薄荷醇、香茅醇、乙酸香茅酯、對艸孟烷-3,8-二醇、β-石竹烯等[2]，廣泛應用于日化、食品以及醫藥等行業[3-5]。

檸檬桉作為一種遺傳相對穩定的樹種，一直在廣西推廣種植。由于其枝葉內含物豐富，用其莖尖誘導產生叢生芽難以成功，無性系選育一直受扦插育苗、組培育苗成活率低(幾乎等于零)的限制，廣西渠黎林場成功地進行檸檬桉幼苗的嫁接，嫁接苗成活率提高到75%以上[6-7]。1994年廣西壯族自治區林業科學研究院對檸檬桉莖尖進行組培繁育，莖尖誘導篩選出適合檸檬桉繼代培養和生根培養的培養基[8]。目前針對檸檬桉組培苗移栽后生長情況的研究鮮見報道。筆者選取廣西壯族自治區林業科學研究院組培檸檬桉(6年生)，測定檸檬桉生物量、葉綠素以及揮發油含量，旨在為檸檬桉油用林合理經營提供科學依據。

1 材料與方法

1.1試驗地概況檸檬種植試驗地位于廣西壯族自治區林業科學研究院試驗苗圃內( 108°21′E，22°56′N)，海拔90～100 m，該區域屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫約21.6 ℃，極端最高氣溫39.4 ℃，極端最低氣溫為12.8 ℃，雨量充沛，年平均降水量1 304.2 mm，平均相對濕度79%。

1.2儀器與藥品超聲波水浴鍋(CS-24，常州朗博儀器制造有限公司)；UV-2550型紫外-可見分光光度計；TP3200電子天平；EGLL - 230B電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；不銹鋼電熱蒸餾水器(TT-98-Ⅲ，天津市泰斯特儀器有限公司)；TQ456氣質聯用儀(美國BRUKER公司)；Aglient 7890A氣相色譜儀，彈性石英毛細管柱BR-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)。

丙酮、乙醇、甲醇(AR級，西隴化工股份有限公司)；95%乙醇(廣東光華化學廠有限公司)。

1.3葉綠素提取隨機抽采2017年8月廣西壯族自治區林業科學研究院試驗苗圃內6年生組培檸檬桉鮮葉，記錄鮮葉總量，去除黃葉和枯葉，洗凈后切成0.5 cm段，備用；丙酮、甲醇和乙醇均為AR級，蒸餾水自制。按體積比配制提取液(表1)。

表1 提取液配制

將一定量切碎處理后的檸檬桉鮮葉樣品，放入試管中，在試管中分別加入10 mL 1#～11#提取液，密封試管口。然后將盛有樣品的試管置于超聲水浴鍋中，在黑暗條件下超聲一定時間后，當肉眼觀察葉組織完全變白時，說明浸提完全，收集浸提液。葉綠素a和葉綠素b的最大吸收波長分別為663和645 nm，在663和645 nm波長下分別測定吸光度，以提取液做空白對照，將所得數據按公式(1)、(2)和(3)，分別計算檸檬桉鮮葉在不同浸提液下提取的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量(mg/g)。

葉綠素a=(12.7A663-2.69A645)×V/1 000×m

(1)

葉綠素b=(22.9A645-4.67A663)×V/1 000×m

(2)

總葉綠素=(8.02A663+20.21A645)×V/1 000×m

(3)

式中，A663和A645分別表示特定波長下葉綠素提取液的吸光度；V表示提取液的體積(mL)；m表示所用檸檬桉鮮葉組織鮮重(g)。

1.4檸檬桉揮發油提取與測定揮發油提取參考《中華人民共和國藥典》2005年版第一部附錄XD中揮發油測定法甲法中水蒸氣蒸餾法[2]。采集檸檬桉組培苗，將檸檬桉鮮葉切成斷，取一定量的葉裝入2 000 mL圓底燒瓶，裝上揮發油測定器和冷凝管，控制回流速度為1滴/s，蒸餾時間為2 h，收集油樣。

采用氣相色譜對檸檬桉葉油進行定量分析，并參照黎貴卿等[1]和田玉紅等[2]氣-質聯用的定性分析數據以及GB/T 22179—2008，確定主要成分及含量。

2 結果與分析

2.1葉綠素采用不同提取液進行葉綠素提取，在分光光度計上掃描葉綠素浸提液的吸收光譜。結果表明，所得到的吸收光譜基本相似，長波長段的吸收峰也基本相似(圖1)。說明所用提取液針對葉綠素溶解的化學性質基本相同，采用公式(1)、(2)、(3)計算葉綠素含量，結果見表2。

圖1 檸檬桉鮮葉葉綠素在不同提取液中的吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of chlorophyll of Eucalyptus citriodora in different extracts

提取液編號Extract solu-tionnumber檸檬桉葉質量The weight of Eucalyptus citriodora leaves∥gA645 nmA663 nm葉綠素aChlorophyll amg/g葉綠素bChlorophyll bmg/g總葉綠素Total chlorophyllmg/g10.2660.2150.5571.2220.4371.65920.2970.3080.8181.6110.5452.15630.2340.2150.5791.4480.4741.92340.2450.0770.2130.5100.1570.66750.3210.3440.9901.8150.5072.32370.3930.3040.8061.1990.4071.60660.2860.2830.8041.6500.4762.12680.2180.1560.4531.2220.3341.55590.2080.2180.6161.7400.5092.249100.2230.2310.6591.7410.4972.238110.2050.1920.5271.5100.4731.983

用不同提取液對檸檬桉鮮葉進行浸提，結果表明，不同提取液提取的葉綠素總量存在明顯差異(表2)。丙酮、乙醇混合液以及丙酮、甲醇混合液提取的葉綠素含量較高，顯著高于70%、80%、90%丙酮以及無水丙酮。丙酮∶乙醇=1∶1提取得到的檸檬桉葉綠素含量最高，為2.323 mg/g，葉綠素a/葉綠素b為3.580。

2.2揮發油由圖2和表3可知，檸檬桉鮮葉揮發油鑒定出21種化合物，占揮發油含量的97.193%，其中含量最高的為香茅醛(76.873%)，其次是香茅醇(7.46%)，新異胡薄荷醇和異胡薄荷醇含量共為9.456%，乙酸香茅酯為1.106%。

不同月份檸檬桉鮮葉含油率以及揮發油含量見表4。由表4可知，試驗地組培檸檬桉揮發油含量雖隨著季節變化呈一定趨勢，但總體差別不大，10月的檸檬桉含油率最高，香茅醛含量最高，該地區組培檸檬桉油用林最佳采收時間為10月，其揮發油特征組分含量符合國家標準要求，得到的油質較好，僅1月檸檬桉揮發油得率較低，檸檬桉得到的揮發油特征組分含量也符合國家標準。

圖2 檸檬桉葉揮發油總離子圖Fig.2 Total current chromatogram of Eucalyptus citriodora oil

3 結論與討論

葉綠素是衡量植物生長狀況的重要指標之一。采用不同浸提液對組培檸檬桉鮮葉進行浸提，葉綠素測定結果整體存在顯著差異。從試驗結果看，丙酮、乙醇混合浸提液對檸檬桉鮮葉葉綠素提取效果最佳。

揮發油含量是衡量檸檬桉油用林品質的首要標準。通過不同月份采集檸檬桉鮮葉提取揮發油試驗，結果發現，組培檸檬桉得油率不高，且隨季節變化不顯著，僅1月份檸檬桉得油率最低，但揮發油特征組分均符合檸檬桉(精)油國標要求。建議避開1月采葉蒸餾。

表3 檸檬桉葉揮發油成分

表4 不同月份檸檬桉鮮葉揮發油含量

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