RNA結合蛋白QKI-5、Ezrin在漿液性卵巢癌中的研究

朱士杰，施正祥

(1.浙江大學舟山醫院婦產科；2.神經內科，浙江 舟山 316000)

在人類的卵巢腫瘤患者中，其疾病的病理類型復雜，其中上皮性卵巢腫瘤的患者占大多數，包括黏液性、子宮內膜樣以及漿液性的腫瘤及三種主要的亞型，三種亞型中漿液性的卵巢腫瘤患者占大多數[1]。漿液性卵巢癌具有容易轉移、早期臨床癥狀不明顯以及散播廣泛的生物學行為，在患者中超過70%的在明確診斷的時候已經處于腫瘤的晚期，病人的5年生活率比較低，僅僅有30%[2]。漿液性的卵巢腫瘤由于早期的癥狀不明顯，所以其死亡率已經成為婦科的惡性腫瘤中的首位，已然成為威脅人類女性健康的主要的癌癥之一[3]。漿液性卵巢癌的發生以及發展的機制尚未明確，所以尋找其的發病相關基因，并且及時阻斷發病過程的關鍵環節在目前具有至關重要的意義[4]。

近些年的研究數據顯示，miRNA通過調控有些致癌基因以及抑制腫瘤細胞基因的表達從而影響腫瘤細胞的遷移、增殖以及凋亡等的過程[5]。亦有大型研究顯示，埃茲蛋白(Ezrin)在癌細胞中的異常表達，能夠在惡性腫瘤細胞的轉移以及浸潤的過程中發揮著至關重要的作用[6]。RNA結合蛋白QKI-5作為一個重要的轉錄調節因子，能夠調節目的mRNA的穩定性、定位以及翻譯的效率，從而影響細胞的生理以及病理的發展過程[7]。本研究通過檢測RNA結合蛋白QKI-5、Ezrin等指標在正常人群的卵巢上皮組織和漿液性卵巢癌患者組織中表達的差異，探討其與漿液性卵巢癌發生以及發展的相關性。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2012-2017年在舟山醫院就診的卵巢漿液性腫瘤患者40例，納入標準：①年齡滿18周歲；②患者均未接受過新輔助化療；③未合并其他嚴重合并癥，如嚴重的肝腎功能不全等；④神志清，臨床依從性好；⑤將研究告知患者以及家屬，得到同意并且簽署知情同意書。排除標準：①診斷不明確；②合并其他嚴重的疾病；③患者臨床依從性差。在我院門診招募20名健康受試者。

根據上述納入以及排除標準，共有40名患者被納入本研究當中，作為觀察組研究對象，招募的20名健康受試者作為對照組。本研究經過我院倫理委員會審查通過。

1.2方法

1.2.1石蠟組織切片制備

將組織放置于5倍體積的10%福爾馬林溶液中，并進行24h的固定。將組織中的水分在由低到高濃度梯度的乙醇中脫去，將玻片在二甲苯中進行浸泡至組織透明。在熱板上將組織中所含軟硬石蠟進行融化，并將其平穩轉移置冷凍面板上，充分進行冷卻凝固。然后將蠟塊固定好，在42℃ddH2O中，將3μm厚組織展平，在防脫載玻片表面，將切片平整貼附，將其放置于玻片盒中風干過夜。

1.2.2標本的處理

收集的觀察組的患者，其術中切下的癌組織直接放入凍存管中，放在液氮中干燥，并轉移至-80℃冰箱中保存。對照組的卵巢上皮細胞，是在開腹手術中或術后使用無菌細胞刷刷取卵巢表面的卵巢上皮細胞直接放入加入1mL Trizol的無菌的1.5mLEP管中，術后放入液氮中保存。

1.2.3 RNA結合蛋白QKI-5的測定

將40例觀察組漿液性腫瘤患者的腫瘤組織樣品和20例對照組受試者卵巢上皮細胞樣品取出，按照試劑盒說明書的操作方法對于組織樣品進行處理之后，使用實時定量的(polymerase chain reaction，PCR)方法對于組織樣本中的RNA結合蛋白QKI-5的表達水平進行測定，并且及時記錄數據。

1.2.4 Ezrin的測定

將40例觀察組漿液性腫瘤患者的腫瘤組織樣品和20例對照組受試者卵巢上皮細胞樣品取出，采用免疫組織化學多聚體標記兩步法對于樣本進行檢測，其Ezrin在卵巢腫瘤組織與正常的卵巢上皮組織中的表達評分由其染色強度劃分成為4個等級，染色陽性百分比也劃分為4個等級。

1.3統計學方法

對于RNA結合蛋白QKI-5與 Ezrin測定結果的判斷是由兩名資深的主任醫師在雙盲下讀取，并且取均值進行統計處理。本研究中的所有數據全部采用統計學軟件SPSS 19.0進行分析，計量資料使用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料使用例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中QKI-5 mRNA水平的差異

QKI-5 mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達顯著的下調，差異具有統計學的意義(t=2.71，P=0.01)，這說明QKI-5在卵巢腫瘤組織中可能是一種抑制癌細胞的基因，見圖1。

注：*表示P<0.0001。

圖1漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中QKI-5mRNA水平的比較

Fig. 1 Comparison of QKI-5 mRNA levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中Ezrin mRNA水平的差異

Ezrin在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達顯著的下調，下調大約4倍，差異具有統計學意義(t=3.72，P<0.01)，見圖2。

注：*表示P<0.0001。

圖2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中Ezrin水平的比較

Fig. 2 Comparison of Ezrin levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.3卵巢腫瘤組織和正常卵巢上皮組織中Ezrin的比較

Ezrin染色強度的劃分，依次為陰性：-；弱陽性：+；陽性：++；強陽性：+++，觀察組40例卵巢腫瘤組織樣品中，Ezrin顯示陽性的有39例，僅僅有1例染色結果陰性，其陽性率為97.50%，見圖3。在20例對照組受試者卵巢上皮組織細胞中，其陽性幾率為100.00%，兩組之間比較無顯著性差異(χ2=0.51，P=0.48)，見表1。

圖3 Ezrin染色強度的劃分

3討論

卵巢腫瘤是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，其致死率一直穩居婦科腫瘤的首位[8]。在卵巢腫瘤的類型中，漿液性的卵巢腫瘤占大多數。但是對于漿液性的卵巢腫瘤的發生以及發展機制，至今尚未清楚。近年來，越來越多的研究均圍繞漿液性卵巢癌組織的發病以及發展機制進行[9]。最近的研究均證實，漿液性的卵巢腫瘤的發生以及發展機制與輸卵管的上皮細胞病變有相關性。目前，有研究已經選取了輸卵管的上皮細胞組織作為對照，用來研究上皮性卵巢腫瘤的發病機制[10]。

3.1不同卵巢組織上皮細胞中QKI-5 mRNA的差異

QKI是一種STAR家族的結合蛋白，在其進化的過程中具有高度保守的特征，并且在人類機體的神經系統發育過程中，是髓鞘發育的至關重要的蛋白質之一。在小鼠中，QKI基因的突變能夠導致小鼠在出生之前就死于心血管肌肉系統的發育缺陷，或者在小鼠出生之后，臨床表現為快速的震顫以及強直性的驚厥發作[11]。QKI在血管的發生、細胞粘附、細胞生長以及細胞凋亡等的過程中，亦發揮著及其的調節作用。QKI-5在神經管的發育中，存在于多種細胞中均有表達，在成體的神經元中反而沒有表達[12]。在QKI的家族中，只有QKI-5在胚胎的形成過程中亦有表達，是其發育過程中表達量最高的異構體[13]。先前的研究結果表明，QKI-5在多種腫瘤組織中的表達均比較低，可能影響腫瘤組織細胞的分化與增殖[14]。然而，QKI-5在卵巢腫瘤細胞中的表達趨勢以及細胞學功能尚不清楚。在本研究中，QKI-5 mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達顯著的下調，且差異具有統計學的意義(P<0.05)，這說明QKI-5在卵巢腫瘤組織中可能是一種抑制癌細胞的基因。

3.2漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中Ezrin mRNA水平

在本研究中，Ezrin mRNA在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達顯著的下調，下調大約4倍，并且差異具有統計學的意義(P<0.05)。Ezrin 蛋白在2004年采用基因芯片的高等技術，在兩種間葉來源以及高低轉移的能力不同的骨肉瘤以及橫紋肌腫瘤中發現的[15]。有研究表示，Ezrin是細胞膜和細胞骨架之間的連接蛋白，參與細胞膜區域的整合調節，以及細胞膜區域的穩定性的調控，同時Ezrin能夠調節細胞膜內外的信號轉導，但是其在腫瘤組織中的作用卻尚未達成統一的意見[16]。有研究者采用免疫組織化學檢測的技術進行檢測，發現Ezrin在幾種軟組織腫瘤中存在較高的表達，比如脂肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、滑膜肉瘤以及惡性外周神經鞘瘤等，并且Ezrin和上述幾種軟組織肉瘤的浸潤性的生長過程有著密切的相關性[17]。

3.3漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞中Ezrin的蛋白水平

在本研究中，觀察組的Ezrin顯示陽性率為97.5%，而對照組受試者卵巢上皮組織細胞中，其陽性幾率為100%。有研究亦發現，Ezrin在子宮內膜腫瘤細胞中的表達較高，并且其的高表達行為與患者的總生存期呈現反比例的關系，同時發現Ezrin能夠作為侵襲性子宮內膜腫瘤的獨立的危險因素存在[18]。但是也有很多研究發現，Ezrin在腫瘤組織中出現表達下調的現象，并且還存在重新定位的可能性，過度表達的Ezrin可能抑制腫瘤細胞的發生以及發展過程[19]。有研究者發現，Ezrin和Moesin在結直腸腫瘤患者中的表達有下調的現象，并且存在著重新定位表達在細胞膜上的現象，Ezrin的表達和Dukes的分期呈現負相關的關系[20]。

綜上所述，RNA結合蛋白QKI-5、Ezrin的表達下調與漿液性卵巢癌患者腫瘤組織的發生發展等的臨床病理過程息息相關，所以這兩個指標有望成為卵巢癌早期診斷指標，并為卵巢癌患者臨床治療提供新思路。

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