姜黃素抑制CD44+結腸癌細胞增殖的體外實驗研究①

郗雪艷 付 飛 樊 旭 杜伯雨

(湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，十堰 442000)

①本文為國家自然科學基金應急管理項目(81650019)和湖北省科技廳面上項目(2017CFB551，2017CFB462)。

②通訊作者，E-mail:du.boyu@hotmail.com。

作者簡介：郗雪艷，女，博士，副研究員，主要從事腫瘤免疫方面研究，E-mail:xixueyan2001@126.com。

據(jù)我國2011年流行病學調(diào)查結果顯示，結腸癌在惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中均排第五位，分別為23.03/10 萬和11.11/10萬[1]。由于傳統(tǒng)術后化療藥物毒副作用大、靶性不強、療效差且易產(chǎn)生耐藥性，術后復發(fā)和轉移是結腸癌治療失敗的主要原因。因此尋找特異性靶點并克服結腸癌的耐藥性是結腸癌治療中亟待解決的問題之一，對降低結腸癌的發(fā)病率并提升病人的生存質(zhì)量至關重要。越來越多的證據(jù)表明，結腸癌組織中可能存在數(shù)量稀少的結腸癌腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSC)[2-4]，其具有自我更新、增殖和分化的潛能，在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移中起重要作用。結腸癌組織中腫瘤干細胞標記物CD133和CD44均高表達，O′Brien等[5]最早在2007年發(fā)現(xiàn)人結腸癌手術切除標本中，分離得到的細胞有20%左右是CD133+細胞，并且這種細胞具有干細胞特征，能夠在小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生新的腫瘤細胞。由結腸癌組織分離得到的單一CD44+腫瘤細胞在體外即可形成腫瘤球，并且在裸鼠體內(nèi)接種100個CD44+細胞即可成瘤[6]，說明CD44+結腸癌細胞具有很強的腫瘤干細胞特征。

姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取的生物活性物質(zhì)，屬酸性多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用[7]。近年來，由于其抗腫瘤活性強，抗腫瘤譜廣、毒副作用小等特點，已被廣泛應用到多種腫瘤治療的研究中，其在結腸癌治療中的作用尤為引人關注。研究表明，姜黃素對結腸癌細胞具有細胞毒作用[8,9]，可導致腫瘤干細胞標記物CD44和CD166表達下調(diào)，干細胞成球數(shù)量明顯減少[10]，并且姜黃素衍生物GO-Y030可抑制結腸癌腫瘤干細胞的活性和增殖效應，抑制結腸癌細胞移植瘤生長[11]，提示姜黃素對結腸癌腫瘤干細胞具有抑制作用。

本研究中，我們著重探討姜黃素對CD44+結腸癌細胞的影響。我們首先證明姜黃素可抑制結腸癌細胞HCT116和HT-29細胞的增殖，然后通過Real-time PCR和流式細胞術實驗證明姜黃素處理的結腸癌細胞CD44表達下調(diào)，最后磁珠分選出CD44+的結腸癌細胞，證明姜黃素可抑制CD44+細胞的增殖。本文結果為探討姜黃素作為結腸癌治療輔助性藥物的可能行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 姜黃素，McCoy′s 5A 基礎培養(yǎng)基和MTT購自Sigma-Aldrich公司；胎牛血清購自Gibco公司；FITC標記的CD44抗體購自Ebioscience公司；CD44分選磁珠及磁珠分選專用緩沖液購自Miltenyi公司；Triozol購自Invitrogen公司；逆轉錄酶購自Promega公司；SYBR Green購自ToBoYo公司；PCR引物由生工公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 結腸癌細胞系HCT116和HT-29購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。細胞生長在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的McCoy′s 5A完全培養(yǎng)基中，含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖實驗 0.25%胰酶+0.02% EDTA消化HCT116和HT-29細胞后，用完全培養(yǎng)基制備成單個細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。向96孔板中每孔加入100 μl細胞懸液，37℃過夜培養(yǎng)。然后加入不同劑量的姜黃素處理24 h，每孔加入10 μl MTT作用4 h，最后加入150 μl二甲基亞砜溶解甲臢顆粒，490 nm處讀取吸光度值。細胞存活率=(實驗組平均OD值-空白對照組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)×100%。

1.2.3Real-time PCR 通過 Real-time PCR檢測對照組和實驗組細胞中CD44 mRNA 的表達水平。不同濃度姜黃素處理細胞 24 h后，提取各組細胞總 RNA，MMLV反轉錄成cDNA，再以 cDNA 為模板，通過 PCR 擴增CD44，內(nèi)參為GAPDH。CD44正向引物為：5′-GGCACCCGCTATGTCCAGAA-3′；CD44反向引物為5′-CCTCCTGAAGTGCTGCTCCT-3′；GAPDH正向引物為：5′-AGCTCACTGGCATGGC-CTTC-3′；GAPDH反向引物為5′-CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。之后對溶解曲線進行分析，確保只有單一產(chǎn)物被擴增，然后使用Bio-rad CFX mana-ger3.1軟件進行基因表達分析。

1.2.4流式細胞術 離心收集不同劑量姜黃素和5-氟脲嘧啶(5-FU)處理24 h后的HCT116和HT-29細胞，PBS洗細胞2次后，以100 μl PBS重懸細胞，加入1 μl FITC標記的 CD44抗體，4℃避光作用30 min 后，應用Beckman公司CytExpert流式細胞儀檢測細胞表面CD44表達情況。

1.2.5磁珠分選 CD44+結腸癌細胞分選采用Miltenyi公司的陽性分選磁珠，所有分選過程采用Miltenyi公司專用的緩沖液(130-091-221)。收集細胞懸液后，加入緩沖液1 ml，300 g離心5 min，棄上清，將細胞沉淀重懸于80 μl緩沖液中，加入CD44+分選磁珠20 μl，4℃孵育30 min，期間反復混勻數(shù)次，然后加入緩沖液1 ml重懸細胞，300 g離心5 min，棄上清，同樣操作重復洗細胞2次，沉淀重懸于500 μl緩沖液中，將上述細胞懸液加入分選柱中，收集滴落的細胞液，此為陰性分選的細胞，待細胞懸液滴入完畢后，將分選柱從磁力架上移下，向分選柱中加入500 μl洗液，以活塞推動細胞，收集細胞，此為陽性分選的細胞。分選完畢的細胞以流式細胞術進行鑒定。

2 結果

2.1姜黃素抑制結腸癌細胞增殖 不同劑量姜黃素作用于結腸癌HCT116和HT-29細胞24 h后，應用MTT方法檢測姜黃素對兩種結腸癌細胞增殖的影響，結果如圖1所示，姜黃素可抑制HCT116和HT-29細胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性關系。

2.2姜黃素可致結腸癌細胞CD44 mRNA表達下調(diào) 不同劑量的姜黃素處理結腸癌細胞24 h后，應用Real-time PCR檢測結腸癌細胞干細胞標記物CD44的表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參，結果如圖2所示，不同劑量的姜黃素處理結腸癌細胞后，干細胞標記物CD44的表達水平在HCT116和HT-29兩種結腸癌細胞系中均呈現(xiàn)劑量依賴性下降。

2.3姜黃素可致結腸癌細胞表面CD44表達下降 分別應用姜黃素和5-FU處理結腸癌細胞HCT116和HT-29，流式細胞術檢測結腸癌細胞表面CD44表達的水平，結果如圖3所示，隨著姜黃素劑量增加，結腸癌細胞HCT116和HT-29表面CD44表達水平逐漸下降；而不同濃度的結腸癌廣譜化療藥物5-FU雖然可以有效的殺傷結腸癌細胞，但并不能引起CD44表達下調(diào)。

圖1 姜黃素抑制結腸癌細胞系HCT116和HT-29增殖Fig.1 Proliferation inhibition effect of curcumin against colon cancer cells,HCT116 and HT-29

圖2 姜黃素處理后的結腸癌細胞系CD44的表達下調(diào)Fig.2 Downregulation of CD44 expression in colon cancer cells treated with curcuminNote: *.P<0.05.

2.4姜黃素抑制CD44+的結腸癌干細胞的增殖 應用磁珠分選法分離結腸癌細胞系HCT116和HT-29中CD44+和CD44-細胞，加入不同劑量姜黃素和5-FU處理24 h后，檢測細胞增殖情況，結果如圖4所示，不同劑量的姜黃素對CD44+細胞的增殖抑制作用明顯強于其對CD44-細胞的作用，而不同劑量的5-FU對CD44+和CD44-結腸癌細胞的增殖抑制作用在兩種細胞之間并未有明顯差別，提示姜黃素可特異性抑制CD44+結腸癌細胞的增殖。

圖3 姜黃素處理后的結腸癌細胞CD44表達下降Fig.3 Downregulation of CD44 in colon cancer cell after treated by curcumin

圖4 姜黃素可以抑制CD44+結腸癌細胞的增殖Fig.4 Proliferation inhibition effects of curcumin against CD44+ colon cancer cellsNote: *.P<0.05.

3 討論

作為我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，結腸癌當前仍以手術治療為主，輔以放療和化療。但隨化療時間的延長，結腸癌細胞會逐漸產(chǎn)生多藥耐藥性，導致化療失敗。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤組織中存有少量的腫瘤干細胞有關[12-14]。因此特異性地消滅腫瘤干細胞，使腫瘤細胞失去分化潛能似乎成為腫瘤治療的又一個希望[15]。

近年來，姜黃素對腫瘤干細胞的作用引人關注，姜黃素可導致腫瘤干細胞標記物CD44和CD166表達下調(diào)，干細胞成球數(shù)量明顯減少[8]。本研究中，我們著重探討姜黃素對CD44+細胞的影響。本研究結果首先提示姜黃素可抑制結腸癌細胞HCT116和HT-29細胞增殖，應用姜黃素處理后的結腸癌細胞，其結腸癌特異性干細胞表面標記物 CD44在兩株結腸癌細胞中均有不同程度下調(diào)。同時流式細胞術分析結果提示姜黃素處理的結腸癌細胞表面CD44表達水平隨姜黃素劑量增加而下調(diào)，而添加5-FU的結腸癌細胞表面并未有明顯的CD44表達下調(diào)。此外，應用磁珠分選獲得CD44+和CD44-的結腸癌細胞后，加入不同劑量的姜黃素處理細胞，結果證明姜黃素可特異性抑制CD44+結腸癌細胞增殖。由于CD44+結腸癌細胞已被認為具有很強的腫瘤干細胞特征[6,16,17]，綜合以上結果，提示姜黃素可通過抑制結腸癌腫瘤干細胞增殖達到治療結腸癌的目的。

大量研究表明，姜黃素可以通過直接或間接影響腫瘤干細胞自我更新通路干預腫瘤干細胞生長，例如 Wnt/β-catenin，Hedgehog 和Notch通路[18-20]，但其如何調(diào)控結腸癌干細胞CD44的表達尚不明確，有待進一步研究。而姜黃素作為一種植物來源的藥物，又表現(xiàn)出對結腸癌腫瘤干細胞的抑制效果，未來或可成為治療結腸癌、抑制結腸癌干細胞生長、防止結腸癌復發(fā)的一個重要靶向藥物。

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