瓊脂糖自組裝膜基底型免疫芯片載體制備及抗體固定研究①

馬莉萍 馬生龍 李云霞 聶瑩瑩 韓根亮

(甘肅省科學院傳感技術研究所，甘肅省傳感器與傳感技術重點實驗室，蘭州 730000)

免疫芯片，又稱為抗體微陣列，是實際應用中最重要、研究最多的一種蛋白質芯片。免疫芯片技術結合了抗原抗體反應的特異性和芯片高密度集成優勢，只需少量生物樣品，一次檢測便可獲得幾種甚至幾萬種有關的生物信息或疾病的檢測結果。與傳統的免疫分析方法相比，免疫芯片最大的優點是能夠實現并行、快速、高通量的檢測；同時極大節省時間、試劑，被廣泛應用于蛋白質組學研究，其在疾病診斷、藥物篩選、食品安全和環境監測等領域已顯示出廣闊的應用前景。免疫芯片制備中，載體的表面修飾及抗體固定是影響芯片檢測靈敏度的關鍵因素。目前，免疫芯片載體表面修飾可大致分為兩類：二維表面修飾和三維表面修飾。二維表面修飾包括聚賴氨酸修飾[1]、氨基修飾[2，3]、醛基修飾[4，5]、巰基修飾[6]、鏈霉親合素修飾[7，8]等，它們是通過共價鍵或特殊分子間的高親合力把蛋白質固定在載體表面，所以對蛋白質的固定比較牢固，蛋白質的構象變化較少，有利于保持蛋白質的天然活性。但是二維表面修飾技術制備的載體在發展過程中仍存在不少問題，如:引起抗體蛋白質性質不穩定的問題，動力學檢測范圍窄等問題[9，10]。

三維表面修飾是在玻片表面包被一層凝膠或樹突狀多聚物，這些凝膠或多聚物又可以通過化學反應引入活性基團，以共價結合和物理吸附的方式把蛋白固定在載體表面。已有大量研究證明，這種三維結構的載體對蛋白質的固定量比二維平面載體大得多，而且凝膠的固-液環境使固定在上面的蛋白質不易失去活性[11-13]。所以三維修飾表面是近年來較受關注的修飾方法。研究表明，多糖膜具有三維多孔結構，經水化后可在內部形成固-液狀態的水凝膠結構，這種三維、多孔結構以及濕潤的微環境不但能固定足夠的蛋白質，同時還可以防止蛋白質變性失活[14]。

本文在總結前人對免疫芯片載體表面修飾及探針固定技術的研究基礎上，選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質，利用分子自組裝技術，在玻片表面制成具有三維結構的自組裝多糖納米膜，其經高碘酸鈉氧化，制備出表面帶醛基的免疫芯片載體。從而建立了多糖納米膜基底型芯片載體制備的新方法，為后續免疫芯片的制備和應用提供實驗參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1材料 瓊脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)(Sigma公司，美國)，高碘酸鈉、戊二醛、36%冰乙酸、無水乙醇等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；FITC標記的驢抗兔抗體(上海生工)，FITC標記的兔抗人AFP抗體(上海生工)。

超純水機、電子天平、磁力攪拌器、烘干箱，JSM-6360LV型高低真空掃描電鏡，FTS3000FX 型的傅立葉變換紅外光譜儀，OLYMPUS BX51型倒置熒光顯微鏡，Nanoscope IIIa型原子力顯微鏡。

1.2方法

1.2.1基片的預處理 25 mm×75 mm 光學載玻片用氨水洗液(體積比為氨水∶過氧化氫∶水=1∶1∶5)置搖床上振搖2 h，取出后用超純水清洗干凈，放入1 mol/L HCl中浸泡過夜，再用超純水超聲10 min，無水乙醇超聲清洗2次，每次5 min，置電熱恒溫箱(120℃)烘烤2 h。

1.2.2瓊脂糖自組裝膜載體制備 ①分別配制0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3 min完全溶解；②將2 ml瓊脂糖溶液覆蓋在60℃預熱的清潔玻片上；瓊脂糖室溫凝固后，置37℃烤箱烘干2 h；置室溫保存備用；③將上述制備好的瓊脂糖玻片置于50 mmol/L NaIO4溶液中室溫下活化60 min。接著用0.1 mol/L pH7.4 PBS洗滌5 min×3次，氮氣流吹干。

1.2.3普通醛基載體制備 按照文獻中的方法制備普通醛基載體[15]。清洗好的玻片浸入APTES活化試劑(丙酮稀釋)中20 min后取出，玻片用丙酮、去離子水沖洗，120℃下烘干，然后放入含5%戊二醛溶液中室溫下浸泡2 h，取出用去離子水沖洗5 min×3次，烘干后，至干燥處保存。

1.2.4基片表面抗體探針的固定 探針為FITC標記的驢抗兔IgG和兔抗人AFP抗體，將探針固定至修飾后的載體表面，研究載體對不同蛋白探針的固定效率。

取原始濃度為1 mg/ml的探針溶于含20%甘油的PBS溶液中稀釋，使探針終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml，將探針分子分別鏈接到修飾后基片上，避光，置于濕盒中，37℃固定3 h，然后PBS清洗3次，洗掉未結合的熒光探針，晾干后熒光顯微鏡檢測，獲取熒光圖像。

1.2.5不同基片對抗體分子固定效率的比較 利用最佳條件分別制備普通醛基化載體，瓊脂糖自組裝膜載體，分別固定最佳濃度的抗體探針分子，根據平均熒光強度比較兩種載體對抗體的固定效果。

1.2.6表征 載體表面的形貌用JSM-6360LV型高低真空掃描電鏡(SEM)與原子力顯微鏡(AFM)觀察；在IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀上測定紅外光譜(FTIR)，用來分析載體表面存在的化學鍵；用OLYMPUS BX51型倒置熒光顯微鏡觀察載體表面熒光探針的固定效率。

1.3統計學方法 平均熒光強度使用Image J軟件分析，圖片選取的分析面積為100 μm×100 μm，同一基片選擇10個區域并取其平均值，實驗數據分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1載體的表面形貌

2.1.1SEM表征 本文采用掃描電鏡來觀察活化后基片表面形貌及瓊脂糖自組裝膜的分布情況。圖1是載體表面放大5 000倍的SEM照片，從照片中可以明顯地看到，表面形成了均勻的薄膜結構，瓊脂糖自組裝膜結構緊密、無空隙出現，玻片全部被薄膜均勻包覆。

2.1.2AFM表征 利用原子力顯微鏡對瓊脂糖自組裝膜修飾載體進行表征(圖2)，修飾后的玻片表面具有三維結構，可觀察到高度約為400～600 nm 的錐形顆粒均勻分布于基片之上，呈現密集的凸起，使表面具有一定的粗糙度，這種結構可增大比表面積、提高探針固定率。

2.2載體的表面化學組成 利用紅外光譜分析修飾載體的化學鍵組成，圖3為瓊脂糖自組裝膜修飾載體和修飾載體固定了抗體后的紅外譜圖，由圖可見，二者整體吸收峰位置并無大的改變，兩種載體在3 435 cm-1同時出現峰，為羥基伸縮振動峰。二者在1 714 cm-1處也同時出現一個峰，為羰基伸縮振動峰。與未固定抗體的載體(圖3A)相比，固定了抗體的載體在1 647 cm-1處出現一個尖峰(圖3B)，為C=N 雙鍵特征吸收峰[16]，這是由于載體表面高碘酸鈉氧化瓊脂糖后生成的醛基與蛋白探針上的氨基發生了希夫堿反應后生成的鍵，證明載體表面與抗體產生了交聯反應，表明該修飾載體成功實現了對蛋白探針分子的有效固定。s

圖1 瓊脂糖自組裝膜修飾載體的SEM照片Fig.1 SEM images of carrier modified by agarose self-assembled membrane

圖2 瓊脂糖自組裝膜修飾載體AFM照片Fig.2 AFM micrograph of carrier modified by agarose self-assembled membrane

2.3不同濃度瓊脂糖制備載體對抗體的固定效果 探針為FITC標記的驢抗兔IgG和FITC標記的兔抗人AFP抗體，將探針固定至修飾后的載體表面，研究載體對不同蛋白探針的固定效率。

分別利用質量分數為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的瓊脂糖溶液制備修飾載體，不同濃度瓊脂糖制備的氧化自組裝膜載體對抗體的固定效果見圖4，在低濃度時，隨著瓊脂糖濃度的增加，載體對抗體分子的固定量隨之增加，但當瓊脂糖濃度大于1.0%時，熒光強度下降，因此，瓊脂糖的最佳濃度是1.0%，以此作為后續實驗的濃度工作。

圖3 瓊脂糖自組裝膜修飾載體紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrogram of the carrier modified by agarose self-assembled membraneNote: A.FTIR spectrogram of agarose self-assembled membrane;B.FTIR micrograph of agarose self-assembled membrane immobilized by antibody.

圖4 不同濃度瓊脂糖制備載體對抗體的固定效果Fig.4 Effect of agarose concentration on immobilization efficiency of IgG

圖5 IgG 濃度-熒光強度曲線Fig.5 Curve of IgG concentrations versus fluoresc-ence intensityNote: A.The curve of donkey anti-rabbit IgG concentrations versus fluorescence intensity;B.The curve of rabbit anti-human AFP IgG concentrations versus fluorescence intensity.

圖6 不同修飾載體的熒光照片Fig.6 Fluoroscope images of different modified carrierNote: A.Fluoroscope image of the ordinary aldehyde carrier;B.Fluoros-cope image of agarose self-assembled membrane carrier.

2.4載體對不同種屬來源IgG的固定效率 在載體上固定的抗體探針(IgG)越多，所獲取的熒光信號強度越高[17]。本文選擇FITC標記的驢抗兔抗體和FITC標記的兔抗人AFP抗體為探針，研究瓊脂糖自組裝膜修飾載體對不同抗體的固定效率。將濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml的探針分子分別固定到瓊脂糖自組裝膜修飾載體上，載體對兩種抗體的固定效果見圖5，圖5A為載體對不同濃度FITC標記的驢抗兔抗體的固定效率研究，由圖可見，在一定范圍內隨著IgG濃度的增加，熒光信號強度增大，在IgG濃度為0.4 mg/ml時熒光強度達到最大，而后隨著濃度的增加，熒光信號強度反而減弱。圖5B為載體對不同濃度FITC標記的兔抗人AFP抗體的固定效率研究，載體對該抗體的最佳固定效率為0.3～0.4 mg/ml，而后隨著抗體濃度的增加，熒光信號強度有減弱趨勢。表明瓊脂糖自組裝膜修飾載體可實現對不同種屬來源抗體的有效固定。

2.5不同修飾載體的探針固載效果分析 將濃度為0.4 mg/ml的FITC標記的驢抗兔抗體分別固定在普通醛基化及瓊脂糖自組裝膜表面，不同基片對探針分子的固載效果通過熒光顯微鏡圖片 (圖6)加以分析。圖6A為普通醛基化載體，圖6B為瓊脂糖自組裝膜載體，從圖中可以看出，普通醛基化載體表面有大量FITC探針結合，瓊脂糖自組裝膜修飾載體比普通醛基化載體更強、更密、更均勻。通過Image J軟件統計分析，兩種修飾基片對抗體固定效率見表1，瓊脂糖自組裝膜修飾載體對抗體的固定效率是普通醛基化基片的3.94倍。

表1采用ImageJ軟件對上述2種載體的熒光亮點數量進行統計分析

Tab.1StatisticalanalysisoffluorescentspotamountformedonthetwodifferentcarrierusingImageJsoftware

Carrier typeMean numberof fluorescent dotsOrdinary aldehyde-aldehyde carrier375Agarose nano-membrane carrier1 478

3 討論

在免疫芯片的制備過程中，基片的表面化學處理極為重要，它直接影響探針與基片的結合強度與效率，進而影響雜交結果的靈敏度與準確性。探索優良的基片載體制備方法，提高探針分子的固定密度與強度，仍然是研究的重點。

本文以玻片為載體，以瓊脂糖為基質，利用分子自組裝技術，在玻片表面制成自組裝瓊脂糖納米膜，其經高碘酸鈉氧化為醛基，得到瓊脂糖自組裝膜修飾基片。由于瓊脂糖是一種擁有多種生物活性的高聚物，有著很好的生物相容性，其在載玻片表面形成的自組裝結構具有類似于聚丙烯酰胺的水凝膠特征，這三維自組裝結構又可以通過化學反應引入醛基基團，即可與抗體分子的氨基發生共價偶聯。具有這種三維結構的載體對蛋白質的固定量比二維平面載體大得多，而且凝膠的固-液濕潤環境使固定在上面的蛋白質不易失去活性，因此更有利于固定抗體探針分子。本文的研究也表明：殼聚糖氧化自組裝膜修飾玻片與抗體結合效率高，熒光信號強，點的密度及數量等都要優于普通醛基化玻片。

瓊脂糖是一種多糖，加熱后易溶于水，不同濃度的瓊脂糖在玻片上形成的膜的厚度和孔徑大小也有差異，膜的厚度和孔徑的大小會直接影響蛋白質的固定。瓊脂糖濃度低時膜較薄，對蛋白質的固定量少；隨著瓊脂糖濃度的增加，膜的厚度也增加，但制備的膜容易斷裂，對蛋白質的固定量也少。本實驗中我們選擇了0.6%、0.8%、1.0%、1.2%及1.4%等瓊脂糖濃度，SEM及熒光表征結果都證明瓊脂糖最佳濃度為1.0%，此濃度下制備的瓊脂糖膜較為平整、均勻，載體對蛋白質的固定量最大。

本文的研究表明瓊脂糖修飾載體可實現對不同種屬來源抗體的有效固定，并且其對抗體的固定量是有限的，在一定范圍內對抗體固定的量和抗體樣品的濃度呈正比，當這一濃度達到極限時，蛋白質的固定量就不再增加。分析其原因可能為：其一，空間位阻，蛋白質濃度過高，使得蛋白質的結合位點被封阻，其二，熒光分子濃度過高，發生淬滅。

免疫芯片的制備和應用過程中，載體的選擇以及載體表面修飾是制備質量好、結合力高的芯片的重要環節。本試驗以瓊脂糖為基質材料，建立了一種新的免疫芯片載體制備方法。以此法制備的載體具有操作簡單、低成本的優點，將更有利于在其表面連接抗體分子，為后續免疫芯片的制備和應用提供實驗參考和理論支持。

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