TLR識別在腫瘤化療后免疫應答作用研究①

張延梅 林澤杭 周琛斐 吳 砂

(南方醫科大學基礎醫學院免疫教研室，廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣州 510515)

Toll樣受體是一類可識別病原體相關分子模式的蛋白家族，并可通過激活相關的轉錄因子產生細胞因子及趨化因子以抵抗病原體的入侵[1,2]。目前研究發現，腫瘤細胞經過放療或化療之后，產生一些報警蛋白，即損傷相關分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)，可被機體通過TLRs識別。本綜述重點講述近年來在腫瘤放化療研究中，腫瘤細胞產生的抗原種類，機體TLRs(Toll-like receptors)與之結合的機制，及其在臨床應用方面的研究進展。

1 腫瘤化療或放療后，腫瘤細胞表達的抗原類型

腫瘤細胞經過放療或化療之后的損傷相關分子模式(DAMPs)，到目前為止共發現四種：①熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)；②Ⅰ型干擾素;③高遷移率族蛋白1；④三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)。

1.1熱休克蛋白(HSP) HSP是一類高度保守的蛋白家族，正常情況下在蛋白折疊方面起著重要的作用，參與折疊蛋白的形成。當生活環境發生改變時，HSP產生增加，保護細胞，抵御外界因素改變。乳腺癌阿霉素化療后，轉錄因子brn-3b表達增加，靶蛋白熱休克蛋白(HSP)分泌，磷酸化HSP-27通過死亡域相關蛋白(DAXX)抑制凋亡，HSP-27通過結合細胞色素C抑制凋亡，促使腫瘤細胞產生耐藥性，并促進肌動蛋白的聚合，使乳腺癌細胞具有轉移的能力[3]。在胃癌患者中，過高表達的HSP110導致化療敏感性下降，總生存率降低[4]。熱化療引起腫瘤細胞表面表達大量HSP90，作為一種“找我”信號，樹突狀細胞接觸并攝取HSP90抗原復合物，攝取并提呈給T細胞，引發強力的抗腫瘤免疫[5]。對結腸直腸癌患者，用奧沙利鉑(OXA)和/或5-氟尿嘧啶(5-Fu)治療后，發現細胞釋放高水平的HSP70，促進DC的成熟[6]。

1.2Ⅰ型干擾素(IFN) 干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質，主要由單核細胞和淋巴細胞分泌產生，最近的研究發現用蒽環類藥物處理腫瘤，激活細胞TLR3受體，通過旁分泌和自分泌途徑分泌Ⅰ型干擾素[7]。基因表達分析發現化療后殘余瘤細胞干擾素誘導基因表達增高，引起SATA1的磷酸化和IFN-γ的釋放，大量的DNA受損和腫瘤細胞的凋亡，激活SATA1通路，但效應在3周之后消失[8]。

1.3高遷移率族蛋白1(HMGB1) HMGB1是在真核細胞中發現的非組蛋白染色體蛋白，具備DNA結合的特性，能夠調控DNA復制、翻譯、再結合和染色體穩定等過程。HMGB1還和細胞的運動性和侵襲性有關，是一種與腫瘤進程相關的蛋白。41名乳腺癌患者接受表柔比星和多柔比星化療的輔助化療(NCT)，發現早期血漿中HMGB1的濃度變化明顯，且HMGB1濃度越高，腫瘤退化越明顯，可作為一種NCT最終反應的生物標記[9]。進一步研究發現，HMGB1化療前后差值大于1.1 ng/ml的患者擁有更高的五年生存率[10]。腫瘤細胞在化療藥物的刺激下，通過絲氨酸蘇氨酸激酶3(RIP3)和混合譜系激酶(MLKL)通路，誘發細胞程序性死亡，釋放HMGB1刺激抗瘤反應[11]。淋巴瘤細胞通過HMGB1引發自噬反應，抑制細胞凋亡，產生耐藥性[12]。然而在小鼠肺癌和人結腸癌細胞，化療存活下來的細胞通過糖基化終末產物受體(RAGE)，抑制腫瘤壞死因子α的釋放，激活處在靜止期的剩余腫瘤細胞，引起腫瘤的再生和轉移[13]。

1.4三磷酸腺苷(ATP) ATP是一種不穩定的高能化合物，是人體細胞的直接能源物質，在細胞的生長、增殖等過程中起著重要作用，近來發現ATP還是一種報警蛋白。腫瘤細胞進行化療后，引起免疫原性細胞死亡(ICD)，釋放大量ATP到血漿中，刺激垂死腫瘤細胞周圍免疫受體的增加[14]。

2 DAMP與Toll樣受體結合的多樣性

TLR是腫瘤化療或放療后產生的DAMP增強抗腫瘤免疫應答的主要結合受體，到目前為止，在人類基因組中已發現10個Toll受體家族成員，為TLR1～TLR10。根據受體位置的不同，可分成膜受體和膜內受體兩類，其中TLR1、2、4、5、6、10定位于細胞膜，結合細胞表面或游離的配體；而 TLR3、7、8、9定位于細胞內，為核酸成分的受體。不同的TLR特異性結合不同的配體，DAMP可識別多種TLR并激活其下游通路，DAMP和TLRs進行結合，主要通過以下兩個通路對細胞的生理過程進行調節，使其產生相應的生物效應[15,16]。見圖1。

圖1 TLRs/MyD88依賴性與非依賴性信號通路Fig.1 TLRs/MyD88 dependent and independent pathway

2.1MyD88依賴性通路 即TLR通過與MyD88直接結合(TLR5/7/8/9)或與TIRAP/MyD88復合物結合(TLR1/2/4/6)激活下游的IRAKs-TRAF6繼而激活IKK復合物通路，從而激活轉錄因子NF-κB使促炎性因子的產生增加[16]。除了TLR3之外，其他所有TLRs都可通過這個通路誘發相應的生物效應。

2.1.1HMGB1 HMGB1可與TLR2和TLR4結合，但二者的結合在結構及機制上均有所不同，在核小體中的HMGB1與TLR2結合，游離的HMGB1則與TLR4結合[17]。Apetoh等[18]發現，全身化療或局部化療放療后的腫瘤細胞所釋放的HMGB1可激活TLR4-MyD88通路，臨床數據顯示，TLR4 Asp299Gly突變后，會影響HMGB1與其受體的結合，從而對乳腺癌患者的預后產生不良影響。

2.1.2HSP HSP主要與TLR4結合，但HSP60可以和TLR2結合[4]。Chen等[19]的研究表明，放療后的腫瘤細胞所釋放的HSP70主要激活DC表面的TLR4-MyD88及TLR4-TRIF通路，從而促進細胞因子的產生及DC細胞的浸潤。同時，Vulpis等[20]報道，化療后的多發性骨髓瘤可通過釋放含HSP70的微囊泡激活NK細胞表面的TLR2，從而增強抗腫瘤的天然免疫應答。

2.2MyD88非依賴性通路 即TLR與TRIF直接結合或與TRAM/TRIF復合物結合，不通過MyD88激活TRAF3-IKK/TBK1-IRF3/7或TRAF6-IKKs-NF-κB通路，進而產生Ⅰ型干擾素[16]。TLRs家族中，TLR3、7、8、9均能通過MyD88非依賴性通路發揮相應的作用。

2.2.1IFN TLR3識別雙鏈RNA/聚肌苷酸-聚胞苷酸[poly(I：C)][21]，IFNα和IFNβ基因的dsRNA的轉錄作用依賴于TLR3[22]。雙鏈RNA類似物Poly I:C作用于前列腺腫瘤細胞，結合TLR3，激活細胞內IRF3依賴性凋亡途徑，然后自分泌IFN作用于細胞，引起細胞凋亡，來抑制腫瘤生長[23]。纖維肉瘤蒽環霉素化療激活TLR3-IRF通路，產生IFN，與腫瘤細胞上的IFN受體結合，產生趨化因子10(CXCL10)，激發抗腫瘤免疫[24]。

2.2.2HMGB1 Yanai等[25]的結果顯示，HMGB1能介導依賴于核酸的TLR3和TLR7的激活，同時，HMGB1可作為DNA的結合蛋白，激活巨噬細胞及DC表面的TLR9，從而介導機體對CpG-DNA的免疫應答[26]。

3 TLRs識別DAMP在臨床抗腫瘤的應用

目前，臨床上對于TLRs識別DAMP的研究應用主要集中在促進DAMP的釋放，同時增強TLR的表達，以加強化療藥物的免疫效應。化療通過促進腫瘤細胞的死亡來恢復機體的免疫監視功能，但Yang等[11]發現，缺乏RIP3和MLKL的腫瘤細胞釋放的HMGB1和ATP會減少，從而產生化療抵抗性，HMGB1可與TLR4結合以激活DC的下游通路，所以在加入TLR4激動劑和ATPase抑制劑后，這種化療抵抗性就會減弱甚至消失。而對乳腺癌患者的回顧性臨床分析顯示，TLR4基因(Asp299Gly)單個核苷酸的突變會阻斷HMGB1與TLR4的結合，從而使患者更容易對蒽環類化療藥物產生抗性[18]。順鉑可使腫瘤細胞死亡，釋放出內容物，包括HMGB1、HSP等，激活DC表面的TLR4-MyD88通路，Belani等[27]做隨機試驗發現對于晚期的非小細胞肺癌，化療藥物順鉑-紫杉醇與TLR2激動劑結合的治療方案與單用順鉑-紫杉醇療法相比，患者127天的平均存活率更高。按化療加免疫方案治療四個循環后，患者總的生存率提高了66天。臨床上理想的誘導免疫原性的細胞死亡的化療藥物應該在腫瘤細胞凋亡之前或早期凋亡階段就可以促進多種類型的DAMP、TLR激動劑及免疫原性分子的釋放，從而確保免疫系統對垂死腫瘤細胞的敏感性增強，促進腫瘤免疫應答[28]。

4 結語

TLR是腫瘤放化療產生DAMP的主要結合受體，在激發機體免疫應答、增強治療效果方面有著重要作用。腫瘤細胞在放療后所釋放的HMGB1、HSP、IFN等物質通過與免疫細胞的TLR結合，激活下游的MyD88依賴性和非依賴性通路，從而發揮天然免疫和適應性免疫作用殺傷腫瘤細胞。ATP也是一種報警蛋白,但目前尚未發現ATP可與TLR結合。對DAMP和TLR的研究有助于闡明機體對腫瘤的免疫應答機制，為診斷、治療腫瘤或研發疫苗提供新思路。目前以DAMP為佐劑的疫苗已經得到廣泛研究，但還未進入臨床應用階段，但TLR激動劑作為化療藥的輔助藥物已經得到廣泛應用。DAMP的釋放有腫瘤異質性及個體差異性，如何設計出有效的個體化疫苗仍是目前亟待解決的問題。

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