重氮偶聯法測定水中亞硝酸鹽氮的改進

閆坤朋，牛成潔，宋志文，徐愛玲，劉 洋

青島理工大學環境與市政工程學院，山東 青島 266033

水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮是水產養殖環境的主要有毒物質，亞硝酸鹽氮能把血液中的血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，使之失去與氧結合的能力。亞硝酸鹽氮也是養殖水體主要的監測對象[1-3]。當水體受到生活污水、養殖廢水、飼料生產與肉類加工等工業廢水中含氮有機物污染后，在水體中產生氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮，亞硝酸鹽氮作為水中氮循環的中間產物，是水環境監測的重要指標[4]。

亞硝酸鹽氮的測定方法有離子色譜法[5]、氣相分子吸收法[6]、分光光度法[7-8]。離子色譜法和氣相分子吸收法簡便、快速、準確、干擾較少，適用于環境水樣的測定，但因需要使用專用儀器，且儀器昂貴，不利于一般實驗室和基層檢測單位的普及。在亞硝酸鹽氮的測定方法中，分光光度法因其方法靈敏、選擇性強、儀器較易獲得、準確性良好而被實驗室廣泛采用，其方法原理：在磷酸介質中，亞硝酸鹽氮與對氨基苯磺酰胺反應，生成重氮鹽，再與N-(1-萘基)-乙二胺偶聯生成紅色染料，在540 nm波長處有最大吸收。但是該國標法的測定上限僅為0.2 mg/L，對于亞硝酸鹽氮含量較高的水樣則需稀釋一定倍數甚至數次稀釋才能進行測量，使測定過程更為繁瑣，增大了測定誤差，降低了測定的準確性。

為克服以上缺陷，本文將亞硝酸鹽氮顯色劑中的磷酸溶液改成鹽酸溶液，將重氮試劑濃度提高到原國標法的3倍，研究該方法對亞硝酸鹽氮檢出上限以及靈敏度、準確度、精密度的影響，取各類含亞硝酸鹽氮污水進行加標實驗，并研究干擾因素對改進法測定的影響。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

UVmini-1240紫外-可見光分光光度計(Nichipet EX可調式移液器，日本)；電子天平。

1.2 試劑及溶液配制

國標法所用試劑、溶液等配制方法參考《水和廢水監測分析方法》[9]：吸取亞硝酸鹽氮標準中間液(50 mg/L)10 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至標線，得到亞硝酸鹽氮標準使用液1(5 mg/L)；吸取國標法中亞硝酸鹽氮中間液(50 mg/L)10 mL于1 000 mL容量瓶中，用水定容至標線，得到亞硝酸鹽氮標準使用液2(0.5 mg/L)。

改進法試劑、溶液的配制方法：取20 mL濃鹽酸(37.5%)溶解于180 mL蒸餾水中，得體積比為1∶9的鹽酸溶液；取15 g對氨基苯磺酰胺溶解于150 mL體積比為1∶9的鹽酸溶液，得到混合液；在混合液中加入0.5 g鹽酸萘乙二胺，混勻并添加蒸餾水定容至250 mL，得到改進法的亞硝酸鹽氮顯色劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 國標法亞硝酸鹽氮標準曲線的繪制

按照國標法步驟進行實驗，獲得校正吸光度后，記錄數據，用最小二乘法繪制出以亞硝酸鹽氮濃度對校正吸光度的標準曲線，得出國標法校準曲線方程、相關系數[10]。

1.3.2 改進法亞硝酸鹽氮標準曲線的繪制

根據鄧勃的分析，在標準曲線的繪制過程中增加實驗點數，可提高標準曲線的整體穩定性，校正曲線中央的精密度優于校正曲線兩端的精密度[11]，故此實驗標準曲線的繪制，從原國標法中的6個點增加到9個點，并將實驗點集中于校準曲線的中央部分，具體操作如下：①向具塞比色管中分別移入0、0.5、1、2、3、4、5、6、7 mL亞硝酸鹽氮標準使用液1(5 mg/L)于9支具塞比色管中，用去離子水稀釋定容至50 mL，對應濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L；②向各比色管加入改良亞硝酸鹽氮顯色劑1 mL，混勻，加塞靜置15 min后測定，2 h內有效；③于分光光度計540 nm波長處，用光程10 mm的比色皿，以去離子水為參比，測定各濃度亞硝酸鹽氮溶液的吸光度，從測得的吸光度，減去零濃度空白比色管的吸光度后，獲得各濃度的校正吸光度；④記錄數據，用最小二乘法繪制以亞硝酸鹽氮濃度對校正吸光度的校準曲線，得出改進法校準曲線方程、相關系數。

1.3.3 國標法和改進法測定水樣的比較

取一高濃度亞硝酸鹽氮水樣，分別用國標法和改進法對該水樣稀釋10倍、30倍、50倍、100倍、200倍進行測定，得出相應校正吸光度，計算各自亞硝酸鹽氮濃度，乘以相應稀釋倍數，得出不同稀釋倍數下國標法、改進法對同一水樣的測定結果，進行對比分析。

1.3.4 改進法檢出限的測定

用改進法對去離子水進行20次空白測定，分析確定改進法對亞硝酸鹽氮測定的檢出限。

1.3.5 改進法檢測結果的準確度、精密度

對已知濃度的亞硝酸鹽氮標準溶液進行6次重復測定，計算平均值、相對誤差、標準偏差、相對標準偏差。

1.3.6 改進法加標回收率

按改進法對各污水水樣進行測定，并同時分別加入一定量的亞硝酸鹽氮標準溶液做回收實驗。

1.3.7 改進法干擾實驗

國標法中測定亞硝酸鹽氮時，水中的硫代硫酸鹽、聚磷酸鈉、高鐵離子會對測定結果產生干擾。選用亞硝酸鹽氮的標準水樣，添加一定濃度梯度的硫代硫酸鈉、三聚磷酸鈉、高鐵酸鈉分別做干擾實驗，檢驗各影響因素對改進法中的干擾影響。

2 結果與討論

2.1 國標法亞硝酸鹽氮校準曲線

按照1.3.1小節中的實驗方法，所得結果如圖1所示?？梢钥闯?，在亞硝酸鹽氮為0～0.2 mg/L的濃度范圍內，亞硝酸鹽氮濃度與校正吸光度呈線性關系y=3.194 4x+0.007，相關系數為0.999 5，靈敏度為3.194 4。

圖1 國標法亞硝酸鹽氮校準曲線Fig.1 Nitrite nitrogen calibration curve of National standard method

2.2 改進法亞硝酸鹽氮校準曲線

按照1.3.2小節中的實驗步驟，繪制以亞硝酸鹽氮濃度為x軸，以吸光度為y軸的改進法校準曲線，如圖2所示。

圖2 改進法亞硝酸鹽氮校準曲線Fig.2 Nitrite nitrogen calibration curve of the improved method

在亞硝酸鹽氮為0～0.6 mg/L的濃度范圍內，亞硝酸鹽氮濃度與吸光度的線性方程為y=3.090 7x+0.007 2，相關系數為0.999 4，呈現出很好的線性關系，與國標法相比，該改進法的測定上限提高了3倍，可能是重氮試劑濃度的增加，使更多亞硝酸鹽氮產生重氮反應，提高了測定上限。標準曲線靈敏度為3.090 7，與國標法靈敏度(3.194 4)基本接近，極差僅為0.103 7，相對極差為3.22%，沒有顯著變化。

2.3 改進法亞硝酸鹽氮的測定

2.3.1 國標法與改進法測定亞硝酸鹽氮結果的比較

配制亞硝酸鹽氮濃度為15 mg/L的標準溶液，將標準溶液準確稀釋10倍、30倍、50倍、100倍、200倍，對國標法和改進法測定的亞硝酸鹽氮濃度進行比較，結果如表1所示。按國標法測定時，將標準溶液稀釋10倍、30倍、50倍，均超過校準曲線的線性范圍，無法準確計算出亞硝酸鹽氮濃度，因此需要繼續稀釋至100倍、200倍。但是由于稀釋倍數過大，導致測定誤差均超過5%，甚至超過10%，對于缺少精密移液器配置的實驗室，誤差將會更大，實現精密測定的難度明顯加大；按改進法測定時，只有在水樣稀釋10倍時，測量結果超過校準曲線的線性部分，其他情況均可測定，當稀釋30倍、50倍時，相對誤差均低于5%，準確度良好。由此可知，按照改進法測定時可稀釋的倍數范圍明顯加寬，節省了高濃度水樣多梯度實驗的時間和藥劑，增強了實驗的可操作性、準確性。

表1 國標法和改進法對亞硝酸鹽氮測定結果的比較Table 1 Comparison of determination of nitrite with national standard method and improved method

注：“—”表示吸光度超過標準曲線線性范圍。

2.3.2 改進法測定亞硝酸鹽氮檢出限

利用改進的亞硝酸鹽氮顯色劑對去離子水進行20次的空白測定，測得吸光度分別為0.050、0.053、0.049、0.048、0.049、0.050、0.052、0.048、0.050、0.050、 0.051、0.049、0.053、0.051、0.051、 0.048、0.047、0.048、0.051、0.050。按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168—2010)標準中方法檢出限的一般確定方法，測定改進法的檢出限[12]：

MDL=t(n-1，0.99)×S

(1)

式中：MDL為方法檢出限，n為樣品的平行測定次數，t(n-1，0.99)為自由度為(n-1)、置信度為99%時的t分布(單側)，S為n次平行測定的標準偏差。當S=0.001 68，n=20，則t=2.539[10]。計算出改進法檢出限為0.004 2 mg/L。

2.3.3 改進法準確度、精密度的測定

移取亞硝酸鹽氮標準溶液2(0.5 mg/L)50 mL于6支具塞比色管中，用改進法測定亞硝酸鹽氮濃度，測量結果如表2所示。其中，6次平行測定的平均值為0.508 mg/L，相對誤差為1.60%，6組數據的相對標準偏差為1.34%。可見，改進法準確度、精密度良好，重復性、穩定性也較高。

表2 標準樣品平行測定的結果Table 2 The parallel determination results of standard samples

注：平均值為0.508 mg/L，相對誤差為1.60%，標準偏差為6.78×10-3，相對標準偏差為1.34%。

2.3.4 改進法的加標回收率實驗結果

選取以海水養殖水、淡水養殖水、水族箱循環水為代表的養殖廢水，以污水處理廠進出水為代表的生活污水，以污水廠排河尾水為代表的地表水，以食品加工廢水為代表的工業廢水，以污水廠排海尾水為代表的海水等各類水樣測定亞硝酸鹽氮的原始值，然后分別加入一定量的亞硝酸鹽氮標準溶液做水樣的回收實驗，計算出加標回收率，測定結果見表3。各水樣的加標回收率(n=9)均為97.0%～104.9%，可見，該改進法適用于生活污水、工業廢水、地表水、養殖廢水等常見污水的亞硝酸鹽氮測定。

表3 水樣加標回收率測定結果Table 3 The results of recovery rate in water samples

2.4 干擾因素對改進法測定的影響

取18支比色管，將3組干擾物質均配制成濃度梯度為0、0.05、0.1、0.15、0.3、0.5 mg/L分別添加至亞硝酸鹽氮標準溶液2(0.5 mg/L)中，測定不同濃度的干擾物質對改進法亞硝酸鹽氮測定的影響,結果如表4所示。結果顯示，在實驗濃度范圍內，硫代硫酸鈉對亞硝酸鹽氮測定的影響不大，因此在水中硫代硫酸鈉濃度低于0.5 mg/L時，可不做干擾處理；三聚磷酸鈉在濃度大于0.15 mg/L后，隨濃度升高，亞硝酸鹽氮的測定結果逐漸降低，呈現負相關，影響亞硝酸鹽氮的測定結果，而在三聚磷酸鈉濃度低于0.15 mg/L時，對亞硝酸鹽氮測定結果影響較小；高鐵酸鈉在濃度大于0.05 mg/L時，即會對亞硝酸鹽氮的測定產生較大影響，隨著高鐵酸鈉濃度的升高，亞硝酸鹽氮測定結果越小。

表4 干擾物質對改進法測定亞硝酸鹽氮的影響Table 4 Effect of interfering substances on determination of nitrite nitrogen by improved method

3 結語

提出了一種重氮偶聯法測定亞硝酸鹽氮濃度的改進方法，針對亞硝酸鹽氮顯色劑進行了改進，具體操作為取15 g對氨基苯磺酰胺溶解于150 mL體積比為1∶9的鹽酸溶液，得到混合液，在混合液中加入0.5 g鹽酸萘乙二胺，混勻并添加蒸餾水定容至250 mL，得到改進法的亞硝酸鹽氮顯色劑。亞硝酸鹽氮的測定步驟不變。

1)通過改進，亞硝酸鹽氮測定上限提高3倍。在測定高濃度水樣時，減少了因稀釋多梯度測定而耗費的時間，減少誤差，簡便操作。

2)改進法與國標法對比反應體系的靈敏度變化很小，改進法測定的準確度、精確度、穩定度良好，檢出限為0.004 2 mg/L，測定上限為0.6 mg/L，加標回收率為96.5%～104.9%，適用于生活污水、工業廢水、地表水、養殖廢水等亞硝酸鹽氮的測定。

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