在線固相萃取-液質聯用法檢測太湖水體微囊藻毒素技術研究

姜 晟，郁建橋，鐘 聲，董南巡，許志波，沈 斐

1.江蘇省環境監測中心，江蘇 南京 210036 2.江蘇省太湖野外水質與藍藻綜合觀測站，江蘇 蘇州 215164 3.蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009 4.無錫市環境監測中心站，江蘇 無錫 214023

太湖地處長江中下游平原，水域面積約2 338 km2，是我國第三大淡水湖[1]。太湖富營養化問題從20世紀80年代開始加劇[2]，突出表現為藍藻水華頻發，水環境質量變差。2007年一度導致無錫市飲用水危機，引起了國內外的廣泛關注[3]。藍藻釋放的微囊藻毒素(MCs)具有肝臟毒性和神經毒性[4]，對腎、腎上腺、肺、胃等器官也有不同程度的損害[5]。微囊藻毒素是具有生物活性的單環七肽化合物，含有2個可變的氨基酸基團，組合形成多種異構體，目前研究較多的為MC-LR、MC-RR、MC-YR 3種(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸、色氨酸)[6]。世界衛生組織(WHO)和中國《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)、《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)已經明確規定了水中MC-LR的濃度限值[7-9]，同時將高效液相色譜法作為推薦的標準分析方法[10]。

近年來，隨著檢測儀器與分析技術的不斷進步，水體微囊藻毒素分析方法不斷推陳出新[11-13]，在線固相萃取-液相色譜串聯質譜技術逐步被用于環境監測工作中，郭娟[14]、張春燕[15]、施儉[16]等先后研究并應用該項技術對標準樣品、水源水、飲用水中的微囊藻毒素含量進行了檢測分析，證明了該方法適用于水中痕量微囊藻毒素的連續、在線、實時監測。與傳統分析方法相比[17]，在線固相萃取-液質聯用法的自動化程度高、定性定量準確、分析效率大幅提升，水樣的在線凈化、富集以及隨后的全自動分析過程顯著降低了背景噪聲和人為操作對分析結果的影響，提高了方法檢出限和分析結果的可靠性與重現性，簡化了水樣預處理的步驟流程。但由于儀器本身購置和運行成本較高，微囊藻毒素也并非現行地表水環境質量標準基本項目，所以目前在國內尚未得到廣泛應用，針對自然水體中實際樣品開展長期連續檢測分析的研究報道則更為少見。江蘇省太湖野外水質與藍藻綜合觀測站作為太湖流域水環境監測站網的前沿樞紐，更加關注藍藻水華監測技術發展動向，于2016年首次使用在線固相萃取-液質聯用法對太湖水體微囊藻毒素含量進行了為期一年的連續觀測和分析，將方法研究與業務應用緊密結合，針對太湖實際水樣摸索建立了一套穩定高效、準確可行、相對先進的地表水微囊藻毒素分析方法，并且開展了長時段、大規模的實際水樣檢測分析，取得了較為令人滿意的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜系統(UPLC H-Class Xevo TQD，美國)。

濾膜：親水性聚丙烯濾膜(Acrodisc Syringe Filter 13 mm 0.2 μm GHP，美國)。

試劑：甲醇(UPLC級，99.95%，中國)，丙酮(GC級，≥97%，德國)，正己烷(HPLC級，≥98%，德國)，甲酸(色譜級，≥98%，中國)，氨水(色譜級，≥25%，中國)，乙腈(GC級，99.8%，德國)，所有試劑使用時未經其他操作。

標準樣品：微囊藻毒素-LR標準物質(純度95%，農業部環境保護科研監測所，出廠日期為2015-10)，微囊藻毒素-RR標準物質(純度95%，農業部環境保護科研監測所，出廠日期為2015-12)，微囊藻毒素-YR標準物質(純度≥95%，Enzo Life Sciences公司，美國,出廠日期為2016-01)；標準儲備液：MC-LR、MC-RR、MC-YR均為2 μg/mL，標準使用液：使用時用超純水稀釋成濃度為0.01～50 μg/L 的混合標準溶液。

1.2 樣品采集與預處理

2016年2—12月，開展太湖水體微囊藻毒素觀測工作，在全湖共布設點位24個(圖1)，監測頻次為每月1次，采樣深度為水面與水下0.5 m，采水器采集水樣后倒入500 mL棕色廣口瓶，密閉并置于船艙陰涼避光處妥善保存。返回實驗室即進行預處理，利用一次性針孔注射器配合親水性聚丙烯濾膜對水樣進行過濾[12]，濾后樣品取15 mL于Waters專用進樣小瓶中，單次分析進樣量為5 mL。

圖1 太湖水體微囊藻毒素監測點位分布Fig.1 Distribution monitoring points in Taihu Lake

1.3 色譜-質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC ?BEH C18色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：含0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(體積比為90∶10)；柱溫：50 ℃；進樣體積：5 mL。采用梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

電噴霧離子源正離子掃描(ESI+)，多反應監測(MRM)模式，毛細孔電壓:3.5 kV，離子源溫度:150 ℃，去溶劑氣溫度：450 ℃，去溶劑氣(氮氣)流速：900 L/h，錐孔氣(氮氣)流速：50 L/h。其他質譜分析參數見表2，標準品色譜圖見圖2。

表2 3種MCs的質譜分析參數Table 2 MS/MS parameters of 3 MCs

圖2 3種MCs多反應監測離子流與總離子流色譜圖(3種物質濃度為1 μg/L)Fig.2 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram of 3 MCs and total ion chromatogram(T1C) (concentration of three substances:1 μg/L)

1.4 在線固相萃取條件

在線SPE柱：Waters Oass? HLB Direct connect HP 20 μm(2.1 mm×30 mm)；進樣量5 mL；流動相A：0.2%氨水溶液，流動相B：0.5%甲酸水溶液，流動相C：0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(體積比為90∶10)，流動相D：甲醇-正己烷-丙酮混合溶液(體積比為33∶33∶33)，梯度洗脫條件見表3。

表3 固相萃取洗脫條件Table 3 SPE elution conditions

2 結果與討論

2.1 方法的驗證

2.1.1 線性范圍和檢出限

配制MCs濃度分別為0.05、0.1、1、10、50 μg/L混合標準溶液，以目標物的峰面積為縱坐標、質量濃度(μg/L)為橫坐標，繪制工作曲線，得到線性回歸方程，相關系數均大于0.99，各目標化合物在線性濃度范圍內呈現良好的線性關反射率擬合模型系。根據環境監測分析方法檢出限[18]可知，該方法檢出限符合并優于世界衛生組織(WHO)和《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)的限值要求(1.0 μg/L)。方法檢出限計算公式如下：

MDL=S×t(n-1,0.99)

(1)

式中：MDL為方法檢出限，n為樣品的平行測定次數，S為n次測定結果的標準偏差，t為自由度為(n-1)、置信度為99%時的t分布的單邊臨界值;當n=7時，t為3.143。結果見表4。

表4 3種MCs線性關系、相關性系數、線性范圍、檢出限Table 4 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

2.1.2 回收率和精密度

在湖水樣品中分別添加0.05、1、20 μg/L 3種不同濃度的混合標準溶液，按照上述方法進行前處理，每個水樣平行測定6次，計算回收率、精密度，結果見表5。可見，低、中、高3個濃度的樣品回收率為85.40%～115.44%，相對標準偏差小于7%，表明該分析方法具有較好的回收率、精密度，在實際水樣檢測方面具有良好的適用性、可信度。

表5 3個加標水平下3種MCs的回收率和精密度(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of 3 MCs from surface water of Taihu lake

2.2 結果分析

1)全部水樣均未發現藻毒素超標現象。3種微囊藻毒素中，MC-LR全湖年均值為0.166 μg/L，全年最大值為0.756 μg/L，未超過《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)及《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)限值(1.0 μg/L)要求；MC-RR全湖年均值為0.089 μg/L；MC-YR全湖年均值為0.126 μg/L。

2)由圖3可見，全年各月藻毒素濃度變化趨勢:7月太湖水體中MC-LR、MC-YR 2種藻毒素含量為全年最高，MC-RR全湖月均值最高的月份為3月、次高為7月，2月3種藻毒素含量皆為全年最低，其他各月有所波動。總體而言，與藍藻水華暴發、消亡時間規律保持一致。

3)將太湖各湖區檢測結果進行比較，由圖4可以發現，西部沿岸是太湖水體藻毒素含量較高的水域。受藍藻光合作用特性影響，表層水體的藻毒素含量與水下0.5 m樣品相比也相對更高。這2個特點均與太湖藍藻水華的水平和垂直空間分布規律保持一致[19]。

圖3 2016年太湖水體MCs變化趨勢Fig.3 Trends of Microcystins in Taihu Lake in 2016

圖4 2016年太湖水體MCs空間分布狀況Fig.4 Spatial distribution of Microcystins in Taihu Lake in 2016

3 結語

提出并建立了一種適用于太湖的水體微囊藻毒素分析檢測方法，該方法靈敏度高、前處理步驟簡單、檢測時間短，線性關系、回收率、重現性等方法學指標較好，檢出限優于現行國際、國內標準要求，十分符合太湖水環境質量監測需要。

利用該方法對2016年2—12月太湖24個監測點位的實際水樣進行檢測。結果表明，樣品中水體微囊藻毒素未檢測到超標現象，全湖藻毒素含量7月最高、2月最低，西部沿岸藻毒素含量高于其他各主要湖區，表層水體藻毒素含量相對更高，藻毒素濃度及變化趨勢與藍藻水華生長分布規律密切相關。

參考文獻(References)：

[1] 王蘇民, 竇鴻生. 中國湖泊志[M]. 北京: 科學出版社, 1998：3-21.

[2] DONG X H, BENNION H, YANG X D, et al. Tracking Eutrophication in Taihu Lake using the Diatom Record：Potential and Problems[J]. Journal of Paleolimnology, 2008,40：413-429.

[3] 秦伯強, 王小東, 湯祥明等. 太湖富營養化與藍藻水華引起的飲用水危機——原因與對策[J]. 地球科學進展, 2007, 22(9)：896-906.

QIN Boqiang, WANG Xiaodong, TANG Xiangming, et al. Drinking Water Crisis Caused by Eutrophication and Cyanobacterial Bloom in Lake Taihu：Cause and Measurement [J]. Advances in Earth Science, 2007, 22(9)：896-906.

[4] GADHI S P, GONG Z Y, BRAMANVAN R B. Environmental Toxicity and Chemistry, 2013, 32(7)：1 574-1 581.

[5] 許秋瑾, 高光, 陳偉民. 微囊藻毒素的研究進展[J]. 中國公共衛生, 2002, 18(6)：761-763.

XU Qiujin, GAO Guang, CHEN Weimin, et al. Research Progress of Microcystin [J]. Chinese Journal of Public Health, 2002, 18(6)：761-763.

[6] 李彥文, 黃獻培, 吳小蓮，等. 固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法同時測定土壤中3種微囊藻毒素[J]. 分析化學, 2013, 41(1)：88-92.

LI Yanwen, HUANG Xianpei, WU Xiaolian, et al. Simultaneous Extraction and Determination of Three Microcystins from Soil Using Solid Phase Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry [J]. Chinese Journal of Analytical Chemist, 2013, 41(1)：88-92.

[7] WHO. Cyanobacterial Toxins：Microcystin-LR. WHO Guidelines for Drinking Water Quality[R]. Geneva：World Health Organization, 1998.

[8] 國家環境保護總局. 地表水環境質量標準：GB 3838—2002 [S]. 北京：中國標準出版社, 2002.

[9] 中華人民共和國衛生部. 生活飲用水衛生標準：GB 5749—2006 [S]. 北京：中國標準出版社, 2006.

[10] 全國食品工業標準化技術委員會. 水中微囊藻毒素的測定：GB/T 20466—2006 [S]. 北京：中國標準出版社, 2006.

[11] 熊杰, 錢蜀, 謝永紅，等. 直接進樣-高效液相色譜-串聯質譜分析水中微囊藻毒素[J]. 中國環境監測, 2014, 30(3)：119-124.

XIONG Jie, QIAN Shu, XIE Yonghong, et al. Determine Microcystin-LR in Water Sample by Direct Injection-HPLC-Tandem Mass Spectrometry [J]. Environmental Monitoring of China, 2014, 30(3)：119-124.

[12] 趙起越, 趙紅帥, 劉保獻，等. 直接進樣-高效液相色譜-串聯質譜法測定地表水中9種微囊藻毒素[J]. 分析化學, 2015, 43(4)：594-598.

ZHAO Qiyue, ZHAO Hongshuai, LIU Baoxian, et al. Simultaneous Determination of 9 Microcystins in Surface Water by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry [J]. Analytical Chemistry, 2015, 43(4)：594-598.

[13] 吳麗, 李欣, 李剛. 直接進樣-超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定地表水中微囊藻毒素-LR[J]. 新疆環境保護, 2014, 36(2)：36-40.

WU Li, LI Xin, LI Gang. Determination of Microcystin-LR in Surface Water by Direct Injection and Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadropole Mass Spectrometry [J]. Environmental Protection of Xinjiang, 2014, 36(2)：36-40.

[14] 郭娟, 趙研, 張晶，等. 飲用水中的9種農藥殘留及微囊藻毒素的在線固相萃取-液相色譜-質譜法測定[J]. 衛生研究, 2012, 41(2)：235-239.

GUO Juan, ZHAO Yan, ZHANG Jing, et al. Determination of Pesticide Residues and Microcystin In Drinking Water Using On-line SPE Liquid Chromatography-Mass Spectrometry [J]. Journal of Hygine Research, 2012, 41(2)：235-239.

[15] 張春燕, 趙興茹, 鄭學忠. 在線固相萃取超高效液相色譜串聯質譜法測定水中微囊藻毒素[J]. 環境化學, 2012, 31(10)：1 663-1 664.

ZHANG Chunyan, ZHAO Xingru, ZHENG Xuezhong, et al. Determination of Microcystins by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with On-Line Solid Phase Extraction in Water [J]. Environmental Chemistry, 2012, 31(10)：1 663-1 664.

[16] 施儉, 景澍閩, 陸峰等. 在線固相萃取-二維高效液相-串聯質譜法測定水中微囊藻毒素-LR[J]. 凈水技術, 2013, 32(3)：52-54, 58, 66.

SHI Jian, JING Shumin, LU Feng, et al. Determination of Microcystin-LR in Water by Online SPE Coupled with Two Dimensional HPLC-MS/MS [J]. Water Purification Technology, 2013, 32(3)：52-54, 58, 66.

[17] 聶晶晶, 李元, 李琴,等. 微囊藻毒素檢測方法的研究進展[J]. 中國環境監測, 2007, 23(2)：43-48.

NIE Jingjing, LI Yuan, LI Qin, et al. Progress on Techniques of Determining Microcystins [J]. Environmental Monitoring in China, 2007, 23(2)：43-48.

[18] 中華人民共和國環境保護部. 環境監測 分析方法修訂技術導則：HJ 168—2010 [S]. 北京：中國環境科學出版社, 2010.

[19] 姜晟, 李旭文, 牛志春，等. 空間分布頻率分析法在太湖水華遙感監測中的應用[J]. 中國環境監測, 2014, 30(1)：196-199.

JIANG Sheng, LI Xuwen, NIU Zhichun, et al. Study on the Spatial Distribution Frequency Analysis Method of Monitoring Water Bloom with Remote Sensing Data in Tai Lake [J]. Environmental Monitoring of China, 2014, 30(1)：196-199.