快速溶劑萃取-凝膠凈化-高效液相色譜法測定土壤中6種鄰苯二甲酸酯

郭文建，張 慧，朱 晨，李紅莉，岳太星，李洪霞，郭文波

1.山東省環(huán)境監(jiān)測中心站，山東 濟(jì)南 250101 2.山東大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250013 3.青島國家海洋科學(xué)研究中心，山東 青島 266071

鄰苯二甲酸酯(PAEs)，又稱酞酸酯，是一類人工合成可起軟化作用的化合物，因其可顯著提高塑料的可塑性和強(qiáng)度，被廣泛用作增塑劑[1]。此外，它也可作為農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲劑、化妝品、潤滑劑、去污劑的生產(chǎn)原料[2]。近年來，隨著PAEs的大量生產(chǎn)和廣泛使用，此類化合物在各種環(huán)境介質(zhì)(如，空氣、土壤、水體)中均被檢測到[3]。已有研究表明，該類化合物具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[4]，可通過呼吸、飲食、皮膚接觸等進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，危害人類健康及生態(tài)環(huán)境[5]。目前，由PAEs引起的環(huán)境污染已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。美國環(huán)保署(US EPA)已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、二乙酯(DEP)、正二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、二辛酯(DNOP)、丁基芐基酯(BBP)6種PAEs列入了“優(yōu)先監(jiān)測污染物名單”，并制定了相應(yīng)的土壤環(huán)境控制標(biāo)準(zhǔn)及土壤污染治理標(biāo)準(zhǔn)。中國也將DMP、DBP、DOP列入優(yōu)先控制污染物黑名單[6]。此外，在2005年開始實(shí)施的全國土壤污染現(xiàn)狀調(diào)查專項(xiàng)中，將PAEs列為土壤必測項(xiàng)目之一[7]。

氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-10]及液相色譜法(HPLC)[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[13-14]是常用的PAEs分析檢測手段。由于PAEs的高沸點(diǎn)特性使得應(yīng)用GC或GC-MS時(shí)的難度增加，相比較而言，HPLC適用范圍更為廣泛，可用于大多數(shù)有機(jī)化合物的檢測分析[15]。此外，要想準(zhǔn)確測定環(huán)境介質(zhì)中的PAEs，樣品的前處理是必不可少的。索氏提取、微波萃取、超聲萃取、快速溶劑萃取(ASE)等是常用的土壤樣品前處理方法[16-17]。較其他方法而言，快速溶劑萃取法具有有機(jī)溶劑用量少，萃取速率快，回收率高等特點(diǎn)，在固體樣品前處理方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。閆蕊[16]等對(duì)比了快速溶劑萃取法、索氏萃取法、超聲萃取法下土壤樣品中11種PAEs的回收率，以及萃取溶劑使用量、萃取時(shí)間等；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，快速溶劑萃取法的回收率最佳、溶劑使用量最少、萃取速率最快，且萃取液的色譜峰干擾少，后2種方法僅對(duì)部分PAEs有萃取作用。

當(dāng)前，文獻(xiàn)中報(bào)道的PAEs檢測方法多為單一PAEs的檢測，并未考慮共存污染物的干擾。然而，實(shí)際的土壤基質(zhì)中往往是多種有機(jī)污染物共存，在對(duì)樣品萃取液采用液相色譜法檢測時(shí)，其他共溶出的有機(jī)物往往會(huì)干擾PAEs的測定，從而使準(zhǔn)確測定PAEs濃度的難度增加。因此，開發(fā)可準(zhǔn)確測定含共存污染物土壤中PAEs濃度的方法很有必要。多環(huán)芳烴(PAHs)是可持續(xù)污染物(POPs)的一種，廣泛存在于土壤中，且大多數(shù)的PAHs 在225 nm波長下均有吸收。因此，共存的PAHs可影響PAEs在其特征吸收波長(200、225、275 nm)下的響應(yīng)，從而干擾PAEs的準(zhǔn)確測定。本文重點(diǎn)是排除共存的PAHs對(duì)PAEs測定的干擾，為后續(xù)準(zhǔn)確測定實(shí)際土壤樣品中的PAEs提供思路。凝膠凈化(GPC)是常用的土壤凈化手段，各組分流經(jīng)凝膠層析凈化柱后，可按分子的大小依次被洗脫出來，采集相應(yīng)時(shí)間段的洗脫液，進(jìn)行后續(xù)檢測。研究表明，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，可有效去除土壤中共存污染物對(duì)16種PAHs的干擾，且具有好的回收率[18]。此外，在土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥的測定方面，也得到了應(yīng)用[19]。目前，還未有關(guān)于PAHs共存的情況下高效液相色譜(HPLC)法準(zhǔn)確測定PAEs方法的報(bào)道。

研究首先通過ASE快速萃取出土壤中共存的16種PAHs與6種PAEs，而后進(jìn)行凝膠凈化，通過對(duì)洗脫液的分段收集，去除共存的PAHs對(duì)PAEs測定的干擾，從而達(dá)到準(zhǔn)確測定土壤樣品中6種PAEs的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本)，配二極管陣列(DAD)和熒光(FLD)檢測器；ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；ASE-350型快速溶劑提取儀(美國)，配34 mL萃取池；LC-Tech凝膠滲透色譜儀；Bio-Beads SX-3凝膠層析柱(500 mm×25 mm，粒徑37～74 μm)；有機(jī)樣品濃縮儀(瑞典)；分析天平(瑞士)；硅藻土(美國)；石英砂(美國)；6種鄰苯二甲酸酯，16種PAHs，購自美國AccuStandard公司；二氯甲烷、丙酮、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、乙腈均為色譜純(美國)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(美國)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

6種PAEs及16種PAHs的儲(chǔ)備液濃度均為100 mg/L，準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以乙腈為溶劑，配成儲(chǔ)備液，于 4 ℃下保存。使用時(shí)，用乙腈逐級(jí)稀釋儲(chǔ)備液，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.3 樣品制備

空白加標(biāo)，準(zhǔn)確稱取5.00 g石英砂，作為空白土壤樣品，加入5 g硅藻土，混合均勻后置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

基體(樣品)加標(biāo)，準(zhǔn)確稱取去除雜質(zhì)的新鮮土樣5.00 g，加入5 g硅藻土，充分混勻、脫水，研磨至散粒狀，作為實(shí)際土壤樣品，置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。土壤樣品干物質(zhì)測定按照《土壤 干物質(zhì)和水分的測定 重量法》(HJ 613—2011)執(zhí)行，樣品定量分析時(shí)全部以干物質(zhì)計(jì)算。

1.4 樣品前處理

將制備好的土壤樣品裝入34 mL萃取池中，以二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)為萃取溶劑進(jìn)行萃取。萃取溫度100 ℃，萃取體積為60%，萃取壓力為1 500 psi，預(yù)熱平衡5 min，靜態(tài)萃取10 min，循環(huán)2次，氮?dú)獯祾?0 s，收集全部提取液，進(jìn)入GPC三聯(lián)機(jī)模式(預(yù)濃縮-凈化-濃縮)。預(yù)濃縮參數(shù)：濃縮腔溫度40 ℃，高真空度0.03 MPa，低真空度0.032 MPa。濃縮參數(shù)：濃縮腔溫度40 ℃，真空度在0.018 MPa,低真空度0.2 MPa。洗脫溶劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比為1∶1)，流速5 mL/min，進(jìn)樣量5 mL，收集12～28 min流出液，并濃縮至1 mL(溶劑置換為乙腈)，待分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(150×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～2 min，流動(dòng)相B保持為55%；2～6 min，B相由55%線性升至100%，保持9 min；15～16 min，B流動(dòng)相降為55%，維持2 min。定量波長為225 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 ASE萃取溶劑的選擇

二氯甲烷、正己烷、丙酮等是常用的PAEs的萃取溶劑。在US EPA 3500方法中采用正己烷-丙酮混合溶劑、二氯甲烷-丙酮混合溶劑提取固體樣品中的PAEs，效果較好。實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)、二氯甲烷-正己烷(體積比為1∶1)、丙酮-正己烷(體積比為1∶1)3種萃取溶劑下PAEs的萃取效率，并篩選出最佳的PAEs萃取溶劑。回收率數(shù)據(jù)表明，經(jīng)二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)提取后，6種PAEs的回收率為90%～121.7%，優(yōu)于其他2種溶劑的萃取效率(圖1)。此外，經(jīng)這3種混合溶劑快速萃取后，PAHs也被萃取出來，且3種混合溶劑作用下16種PAHs的萃取回收率幾乎相同，依次為68.7%～122.1%、73.2%～119.0%、61.0%～109.0%。因此，實(shí)驗(yàn)選取二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)作為土壤中PAEs的萃取溶劑。

注：3種混合萃取溶劑的體積比均為1∶1。圖1 不同萃取溶劑對(duì)PAEs回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent on the recovery of PAEs

2.2 GPC收集時(shí)間的確定

一般來說，實(shí)際的土壤樣品中會(huì)含有多種有機(jī)污染物，在進(jìn)行一般的提取處理時(shí)，共存污染物往往會(huì)同目標(biāo)物一同萃取到溶劑相中，這可能會(huì)對(duì)后續(xù)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量增加難度。PAHs是可持續(xù)污染物的一種，廣泛存在于土壤中。研究選定的色譜條件下對(duì)16種PAHs進(jìn)行了液相-紫外檢測分析，發(fā)現(xiàn)16種PAHs出峰時(shí)間在7.5～12.5 min時(shí)，會(huì)干擾DBP(9.4 min)和BBP(9.7 min)的測定。對(duì)比6種PAEs和16種PAHs的流出曲線發(fā)現(xiàn)，6種PAEs在28 min已經(jīng)完全洗脫，而PAHs在26 min后，才開始有萘的洗脫(圖2)。因此，準(zhǔn)確測定這6種PAEs只需收集12～28 min的流出液，而此時(shí)間段的流出液即能夠保證土壤中PAHs的有效去除，同時(shí)又能夠保證被測組分的全部接收。

為驗(yàn)證經(jīng)GPC凈化后，16種PAHs對(duì)目標(biāo)污染物測定的干擾得到了去除，分別對(duì)凈化前的ASE萃取液和凈化后的流出液(12～28 min)進(jìn)行HPLC檢測分析。取2份等量的空白土壤(石英砂)，分別與5 g硅藻土混勻，然后加入相同量的PAEs和16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)ASE萃取后，一份樣品萃取液經(jīng)直接濃縮、定容后進(jìn)行HPLC檢測分析(圖3)。另一份樣品萃取液進(jìn)行GPC凈化處理，收集12～28 min的流出液，此時(shí)間段流出液經(jīng)濃縮、定容后進(jìn)行檢測分析(圖4)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GPC凈化處理后，16種PAHs的干擾得到了有效去除。這也說明，采用GPC通過收集不同時(shí)間段的流出液來去除PAHs對(duì)PAEs測定的干擾的思路是可行的。

圖2 PAEs、PAHs的GPC流出曲線Fig.2 Outflow curves of PAEs and PAHs

圖3 樣品凈化前色譜圖Fig.3 The chromatogram before purification

圖4 樣品凈化后色譜圖Fig.4 The chromatogram after purification

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 校正曲線與檢出限

取不同濃度的6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL)分別進(jìn)樣，以峰面積對(duì)濃度做線性回歸分析。在選定色譜條件下，6種PAEs的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9。分析7個(gè)空白加標(biāo)樣品，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)。方法檢出限計(jì)算公式如下：

MDL=t(n-1,0.99)S

(1)

式中：MDL為方法檢出限，t(n-1,0.99)為置信度99%、自由度(n-1)時(shí)的t值。求得PAEs的方法檢出限，4倍的檢出限為其測定下限。如表1所示，6種PAEs的檢出限為2.7～11.5 μg/kg,完全滿足實(shí)際樣品的定量分析要求。

表1 6種PAEs的線性方程與檢出限Table 1 Linear equation and detection limits for the determination of six PAEs

2.3.2 方法精密度與準(zhǔn)確度

對(duì)實(shí)驗(yàn)室空白加標(biāo)樣品進(jìn)行方法精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，其中，PAEs加標(biāo)濃度為133 μg/kg；PAHs為66.7 μg/kg，經(jīng)ASE和GPC后，在最佳色譜條件下，進(jìn)行6次連續(xù)測定。由表2可見，6種PAEs濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.23%～10.1%，回收率為76.2%～91.4%，滿足檢測需求。

表2 空白加標(biāo)樣品的回收率、精密度Table 2 RSD and recovery rate of blank spiked soil sample

2.4 實(shí)際樣品分析

對(duì)底泥及表層土壤樣品進(jìn)行分析，2種土壤樣品均有PAEs檢出(表3)。對(duì)2種土壤樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其中，6種PAEs的加標(biāo)濃度分別為66.7、133、267 μg/kg，16種PAHs的加標(biāo)濃度為66.7 μg/kg。由表3可見，在底泥和表層土壤2種樣品不同加標(biāo)濃度下，樣品的平均加標(biāo)回收率為66.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～9.5%。說明該方法穩(wěn)定，回收率較高，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表3 2種土壤樣品中6種PAEs的測定值、加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Determination, recovery rate and RSD of two soil samples (n=6)

3 結(jié)語

研究采用ASE對(duì)土壤中的PAEs進(jìn)行提取，并過Bio-Beads SX-3凝膠層析柱凈化，通過分段收集，消除了土壤中共存的16種PAHs在225 nm紫外波長下對(duì)6種PAEs測定的干擾。此方法的回收率為66.5%～102%，檢出限為2.7～11.5 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～9.5%。方法萃取效率高，精密度及檢出限較好，可適用于含PAHs的土壤中PAEs的準(zhǔn)確測定，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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