近日鐘基因Clock單核苷酸多態性與心肌缺血的 相關性*

陳晨 江舟 王正榮 李光明

(1.四川省科學城醫院，四川 綿陽621900；2.四川大學華西基礎醫學院與法醫學院生物醫學工程研究室，四川 成都 610041； 3. 衛生部時間生物學重點實驗室，四川 成都610041；4.南充市中心醫院，四川 南充637000)

缺血性心臟病(ischemic heart disease)是指冠狀動脈粥樣硬化導致血管腔狹窄或閉塞，或(和)因為冠狀動脈功能性改變(即血管痙攣)所致心肌缺血缺氧，嚴重致心肌壞死而引起的心臟疾病[1-2]。流行病學調查發現近年我國缺血性心臟病發病率逐年升高，嚴重危害人類健康的常見病[3- 4]。本病出現臨床癥狀或致殘、致死等多發生于40歲以后，且男性發病明顯早于女性患者。缺血性心臟病的發病機制，曾有多種學說從不同的角度加以闡述,從最早的脂質浸潤學說，其后的平滑肌細胞克隆學說以及血小板聚集和血栓形成學說。現在學術界傾向于1973年提出的動脈粥樣硬化形成的“損傷-反應學說”。

近年隨著時間生物學的興起，眾多學者及臨床醫務工作者在長期的醫學實踐觀察中發現心肌缺血發病具有近日節律，心肌缺血的節律被認為與心肌電生理、血液流變學、自主神經活動和冠脈血栓形成等的近日節律有關[5-7]。Maemura K等[8-9]采用酵母雙雜交技術對人臍帶血管內皮細胞cDNA進行分析，發現節律基因Clif(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like 2，CLIF)能與近日鐘基因Clock(circadian clock gene)結合形成二聚體，在內皮細胞中Clock、Clif形成的二聚體能與血漿纖溶蛋白溶酶原激活抑制因子-1(serpin family E member 1，Pai-1)基因的E-box結合促進其上調表達產生Pai-1，形成近日節律，這也是心肌梗塞或心絞痛常見于早晨的關鍵因素。為進一步明確近日鐘基因在心肌缺血發生發展中的作用及機制，本研究致力于中國漢族人群中Clock基因多態性與心肌缺血的相關性研究，擬對心肌缺血患者Clock基因多態性進行多位點和多樣本綜合研究，有助于更好地了解心肌缺血發病的機制，進而為缺血性心臟病的預防提供實驗依據，對已患患者群更有針對性地制定個體化治療方案。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2015年1月～2016年1月之間臨床確診的心肌缺血患者120例設為心肌缺血組，年齡38～84歲；同時通過臨床體檢確定為健康人群78例設為健康對照組，年齡40～75歲(樣本例數來自四川省科學城醫院、南充市中心醫院及四川大學華西基礎醫學部)。所有實驗標本的收集均經本醫院的醫學倫理委員會認可并獲得患者知情同意。分別于清晨7時抽取5ml抗凝血液進行生化指標檢測包括甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標，其中3ml留作DNA分離進行基因測定。總膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白指標心肌缺血組明顯高于健康對照組，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)；而高密度脂蛋白指標在心肌缺血組與健康對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。心肌缺血組與健康對照組臨床資料統計分析，見表1。

1.2 試驗試劑和相關儀器 普通 PCR 儀、電泳儀及凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司，NanoDrop 2000c 紫外分光光度計購自美國ThermoScientific公司，電熱恒溫水浴箱購自北京永光明醫療儀器廠。總 RNA 抽提試劑 Trizol 購自 Invitrogen 公司。逆轉錄試劑盒，普通PCR試劑盒(Takara EmeraldAmp PCR Master Mix)與人全基因組DNA提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)購自日本Takara公司。SNaPshot試劑盒購自美國ABI公司。Pai-1和血栓素(thrombomodulin，Tm)酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自美國Sigma公司。近日鐘基因(clock circadian regulator，Clock)干擾試劑盒購自中國上海吉瑪公司。

Table2Comparisonofgeneralandbiochemicalindexesofmyocardialischemiagroupandhealthycontrolgroup

組別心肌缺血組(n=120)健康對照組(n=78)P年齡 (歲)67.2 ± 8.959.8 ± 10.00.022①性別 (女/男)49/7145/330.021①總膽固醇(mmol/L)4.49 ± 1.032.84 ± 0.760.005①甘油三酯(mmol/L)1.92 ± 1.561.23 ± 0.660.002①高密度脂蛋白(mmol/L)1.91 ± 0.851.36 ± 0.310.170低密度脂蛋白(mmol/L)3.75 ± 0.882.78 ± 0.63<0.001①

注：與健康對照組比較，①P<0.05

1.3 方法

1.3.1 人全基因組DNA的提取 選取-80℃保存的血細胞，依照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒說明書，提取各標本中的全基因組DNA，之后使用NanoDrop 2000c 紫外分光光度計測定所提取每個樣本的全基因組濃度，并放于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.2 小鼠總RNA提取及逆轉錄 收集各組小鼠的血漿，按照 RNA 抽提試劑盒說明書抽提總 RNA。用NanoDrop 2000c 紫外分光光度計對提取的總RNA 進行定量后，取1 ug總RNA按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應(reverse transcription，RT )。

1.3.3 普通PCR反應 按照Takara EmeraldAmp PCR Master Mix試劑盒進行普通PCR反應。反應體系如下：PCR Master Mix 10μL，正、反向引物(10 μmol )共2.0μL，模板1μL，滅菌水7μL，引物序列(見表2)。PCR 擴增條件如下：98℃預變性2 min，98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共37個循環，72℃延伸5 min，4℃冷卻30 min，反應結束后置4℃保存。隨后采用1.5 %瓊脂糖電泳檢測PCR產物大小，取出凝膠在凝膠成像系統記錄并鑒定提取結果。

1.3.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 采用雙抗體夾心法測定人群和小鼠血漿中PAI-1和血栓素(TM)蛋白含量的變化表達水平。主要原理如下：用純化的一抗包被微孔板，制成固相抗體，往微孔中加入血清，再加入與酶標記過的二抗結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加顯色劑顯色。

表2 基因引物序列信息 Table 2 Sequence information of gene primers

1.3.5 RNA干擾技術 C57BL/6J 小鼠購自南京動物模式研究，參照Clock干擾試劑盒，采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clock基因的表達，并采用RT-PCR測定小鼠血漿Clock mRNA的表達水平變化。

1.3.6 單堿基引物延伸法基因分型(SnapShot) 按照SnapShot試劑盒進行反應。反應體系如下：PCR產物總體積9μL，Exol酶0.1μL，SAP buffer 0.1μL，SAP 2μL，加滅菌水至總體積12μL。反應條件：37℃ 1 h；75℃ 15min。隨后進行單堿基引物延伸，反應體系：純化后產物1μL，SNapShot Multiplex 1μL，SnapShot primer 0.2μL，加滅菌水至至總體積5μL。反應條件：96℃ 預變性1min；96℃變性10 sec，50℃退火5 sec，60℃延伸30 sec，共25個循環。隨后采用1 %瓊脂糖電泳檢測PCR產物大小，取出凝膠在凝膠成像系統記錄并鑒定提取結果。

2 結果

2.1 兩組患者Clock基因多態性位點基因型及等位基因頻率分布比較Clock基因rs3840267位點的基因型及等位基因頻率分布，在心肌缺血組和健康對照組中差異有統計學意義(P<0.05)。而rs3749474和rs1402963位點基因型及等位基因頻率分布，在心肌缺血組和健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者Clock基因多態性位點基因型及等位基因頻率分布比較[n(×10-2 )] Table 3 Comparison of genotype and allele frequency distribution of Clock gene polymorphic loci in myocardial ischemia group and healthy control group

注：與健康對照組相比，①P<0.05

2.2 兩組Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在不同性別之間的比較 心肌缺血組與健康對照組中Clock基因rs3840267位點的基因表型和等位基因分頻率分布在心肌缺血組與健康對照組中不同性別之間的比較，發現，在女性組中心肌缺血組AA和A型顯著性的低于健康對照組(P<0.05)，見表4、表5。

表4Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在兩組中男性人群的比較[n(×10-2)]

Table4ComparisonofgenotypeandallelefrequencydistributionofClockgeners3840267lociinthemalegroupofmyocardialischemiagroupandhealthycontrolgroup

組別心肌缺血組健康對照組P風險比(95%可信區間)AA54(87.10)27(87.10)11A-8(12.90)4(12.90)-0(0.00)0(0.00)A116(93.55)58(93.55)11-8(6.45)4(6.45)

表5Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在兩組中女性人群的比較[n(×10-2)]

Table5ComparisonofgenotypeandallelefrequencydistributionofClockgeners3840267lociinwomenwithmyocardialischemiaandhealthycontrols

組別心肌缺血組健康對照組P風險比(95%可信區間)AA33 (78.57)39 (97.50)0.009①10.638(1.280～88.379)A-9 (21.43)1 (2.50)-0 (0.00)0 (0.00)A75 (89.29)79 (98.75)0.011①9.480(1.173～76.646)-9 (10.71)1 (1.25)

注：與健康對照組相比，①P<0.05

3 討論

心血管系統廣泛存在著近日節律的變化，無論是心率、血壓、心功能、心肌收縮力等均呈現出近日節律變化的規律，這些節律存在是由近日節律鐘基因的存在通過其自激振蕩而調控心血管系統而形成的心血管系統的近日節律[10-12]。通常心血管系統的近日節律變化的規律可反映出心血管系統正常與否。近日鐘基因的表達正常與否可直接影響心血管系統的生物節律，如clock基因敲除小鼠不但引起自發活動的近日節律的變化，亦導致代謝和心率等變化，甚至造成生長發育和腫瘤等疾病的發生[13-15]。研究發現節律基因Clock可能為中國漢族人群高脂血癥相關基因[16]。而導致高脂血癥冠狀動脈硬化出現心肌缺血癥狀。

本研究提示Clock基因rs3840267位點與中國漢族人群心肌缺血存在關聯性。通過細胞水平和動物實驗研究，采用RNA干擾技術沉默小鼠體內clock基因表達，發現其血漿中Pai-1和Tm表達明顯下調。PAI-1 和TM 是在凝血機制和血栓形成中發揮著重要作用的因子。PAI-1是一種單鏈糖蛋白，當其以活性狀態存在于血漿中時與血漿波基結合素結合，形成復合物提高其穩定性，當PAI-1活性存在時能有效的發揮其生理機能，降低血液的凝血傾向及血栓形成，防止血液在血管內形成血栓[17-18]。TM是位于血管內皮細胞膜表面的糖蛋白，它具有清除凝血酶、活化血液中抗凝因子蛋白C 的作用，在抗凝因子蛋白C 等的協同作用下能促進纖維蛋白的溶解從而降低血栓形成等作用[19-20]。當PAI-1和TM二者的功能失調時，將導致血凝和抗血栓功能失調，特別是PAI-1和TM的基因表達下調時，引起表達產生的PAI-1和TM 減少，會造成抗凝血功能減弱，在血管中易形成血栓。正常情況下，PAI-1和TM的基因屬于鐘控基因，即二者的表達受到Clock的調控。當Clock基因表達異常時，特別是基因發生改變，如SNP等變異后，表達產生的Clock對PAI-1和TM基因調控功能受到影響，主要是造成Pai-1和Tm表達下調，生成的PAI-1和TM量下降，從而引起抗凝血功能下降，血管中的血液容易形成血栓。

通常情況下，Clock基因SNP變化是不足以引起近日節律的完全消失，但是能造成如PAI-1和TM等鐘控基因的表達下調，造成血管中的血液易形成血栓；而Clock基因近日節律仍存在在凌晨自身表達下將形成的CLOCK亦下降，結果造成患者在清晨形成血栓傾向升高，導致冠脈血管狹窄，易出現清晨心絞痛發作，甚至發生血管完全被血栓阻塞致心肌梗塞等近日節律特征的變化。

4 結論

本研究顯示，通過對Clock基因多態性與心肌缺血的關聯性研究，發現Clock基因rs3840267位點多態性與心肌缺血存在關聯。該研究為缺血性心臟病的防治提供了更進一步的實驗依據。

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