線粒體DNA D-loop基因多態性與腎透明 細胞癌發病的相關性分析*

王天浩 閆飛 袁建林 魏迪 朱政 來東 李西安

(空軍軍醫大學西京醫院泌尿外科, 陜西 西安 710000)

腎透明細胞癌是臨床常見的泌尿系惡性腫瘤之一，是腎臟惡性腫瘤最為常見的類型，惡性程度較高，且癌細胞容易脫落而轉移，嚴重影響患者預后。近年其發病率呈逐年升高的趨勢，因此，對其發病機制的研究成為學界和臨床的焦點問題[1-4]。隨著分子生物學的發展，多種腎透明細胞癌的相關腫瘤分子標志物被逐步確立，而作為細胞核外唯一的遺傳物質線粒體DNA(mtDNA)，由于容易發生突變，其與癌癥發病的聯系受到重視[5-8]。D-loop在內的非編碼區域是mtDNA多態性熱點區域，據相關研究表明該區域與多種腫瘤的發病和預后有關[9-12]， 故本文探討了線粒體DNA(mtDNA)D-loop基因多態性與腎透明細胞癌的關系，為臨床研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月～2017年2月在我院治療的腎透明細胞癌患者63例為觀察組，其中男性39例，女性24例；年齡34～68歲，平均年齡(50.17±9.22)歲；納入標準：①均經病理學診斷。②術前未接受化療、放療等治療。③臨床隨訪資料保存完整。排除標準：①不能隨訪者。②合并其他原發性腫瘤者。同時選取健康志愿者70例作為對照，其中男性40例，女性30例；年齡32～70歲，平均年齡(49.83±8.17)歲；觀察組和對照組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 實驗方法

1.2.1 所有患者術前均空腹抽取外周靜脈血，外周血標本當天提取DNA后置于-80℃恒溫冰箱保存。

1.2.2 引物合成及PCR擴增 設計擴增 mtDNAD-loop區的引物沒,上游引物：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'；下游引物：5'-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3'。引物合成和純化均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。PCR 反應采用25μL 反應體積。反應程序：95℃預變性2min,95℃變形30s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，38個循環，最后于72℃延伸 5 min。

1.2.3 DNA測序及結果分析 將 PCR 反應產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司，用 ABIPRISM 3100 DNA 序列分析儀對 PCR 擴增產物進行測序，利用 DNAman 軟件分析腎透明細胞癌患者的mtDNAD-loop區序列，并與人mtDNA文庫記錄的劍橋序列(rCRS)進行比對，篩選出 mtDNAD-loop區的多態性位點。

1.3 統計學分析 統計分析采用SPSS19.0軟件，樣本代表性采用Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗，計數資料比較使用t檢驗，生存曲線采用Kaplan-Meier描繪法，比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mtDNAD-loop基因多態性位點分布 觀察組和對照組mtDNAD-loop區共發現135個多態性位點，其中9個位點分布頻率>5%，包括262、488、523、525、16293、16298、16304、16362和16519。根據Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗，最后發現觀察組和對照組262位點基因型頻率分布符合Hardy-Wenberg定律，其樣本代表性好，其余位點基因型頻率分布不符合Hardy-Wenberg定律。

2.2 兩組mtDNAD-loop區262位點基因型及等位基因頻率比較 觀察組和對照組mtDNAD-loop區262位點基因型及等位基因頻率比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中觀察組TT基因型及等位基因T頻率分布為19.05%和38.89%，明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.3 mtDNAD-loop區262位點多態性與臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、病理分級和臨床分期腎透明細胞癌患者mtDNAD-lOOP區262位點基因多態性分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 mtDNAD-loop區262位點多態性與預后關系 截止2017年9月，CC基因型和CT基因型患者中位生存時間分別為40.40個月和40.20個月，明顯高于TT基因型患者的34.81個月，比較差異有統計學意義(2=25.585，P<0.05)，見圖1。

表2 mtDNA D-loop區262位點多態性與臨床病理特征的關系[n(×10-2)] Table 2 The relationship between polymorphism of 262 locus in mtDNA D-loop region and clinicopathological features

圖1 生存曲線圖 Figure 1 Survival graph

3 討論

線粒體是真核細胞的重要細胞器之一，是呼吸和氧化的中心，并且其攜帶了部分DNA,即線粒體DNA(mtDNA),是細胞核外唯一的遺傳物質, 由16568個堿基對組成，含有3個基因，其中13個為蛋白質基因，2個為 rRNA基因， 22個為tRNA基因[13-15]。mtDNA處于活性氧及其他自由基包圍之中，且缺乏相應組蛋白的保護以及完整的內修復系統，與核內基因組相比，mtDNA較易發生突變[16-17]。mtDNA的多態性熱點區域主要集中在包括D-loop在內的非編碼區域，D-loop區是mtDNA復制的調控區域，所以該區域DNA的復制和表達異常，往往與多種腫瘤的病發和預后具有相關性[18-20]。基因多態性是指由于單個核苷酸變異，引起染色體基因組水平上的DNA序列呈多態性，成為限制性片段長度多態性(RFLP)標志和微衛星標志發現后的第三代標志物，可能與多種腫瘤的病發和預后有關[21-22]。

3.1 mtDNAD-loop基因多態性位點分布分析 本文采用Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗進行驗證，現結果如下：觀察組和對照組mtDNAD-loop區共發現135個多態性位點，根據Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗，最后發現觀察組和對照組262位點基因型頻率分布符合Hardy-Wenberg定律，其樣本代表性好，因此本文選用mtDNAD-loop區262位點基因型頻率為研究對象。

3.2 兩組mtDNAD-loop區262位點基因型及等位基因頻率比較分析 mtDNAD-loop區的基因呈多態性，可能與腎透明細胞癌的發病有相關性，因此本文以262位點基因型及等位基因頻率為指標，發現觀察組和對照組mtDNAD-loop區262位點基因型及等位基因頻率比較差異有統計學意義，其中觀察組TT基因型及等位基因T頻率分布明顯高于對照組，結果具有統計學差異，這表明mtDNAD-loop區262位點TT基因及等位基因T與腎透明細胞癌的發病具有相關性，在一定程度上解釋了腎透明細胞癌的在基因水平的部分發病機制。

3.3 mtDNAD-loop區262位點多態性與臨床病理特征的關系分析 為了排除其他因素對mtDNAD-loop區262位點多態性與腎透明細胞癌相關性的干擾，本文研究了不同性別、年齡、病理分級和臨床分期腎透明細胞癌患者mtDNAD-loop區262位點基因多態性分布，發現結果差異無統計學意義，表明了性別、年齡、病理分級和臨床分期等因素與mtDNAD-loop區262位點多態性不具相關性，進一步確定了其與腎透明細胞癌發病密切相關。

3.4 mtDNAD-loop區262位點多態性與預后關系分析 據相關研究表明，mtDNAD-loop區262位點多態性與腎透明細胞癌的預后具有相關性，因此本文研究了二者的關系，發現CC基因型和CT基因型患者中位生存時間明顯高于TT基因型患者，差異比較有統計學意義，這表明mtDNAD-loop區262位點TT基因型不利患者預后的改善，從而縮短患者的生存周期。

4 結論

本文探討了mtDNAD-loop區262位點的多態性與腎透明細胞癌的關系，從基因水平對腎透明細胞癌的發病機制進行考察，顯示腎透明細胞癌患者mtDNAD-loop區262位點攜帶等位基因T的頻率明顯升高，明確了mtDNAD-loop區262位點多態性與腎透明細胞癌發病的相關性。但其與臨床病理特征無明顯關系，有先進進一步研究。

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