生香酵母發酵桑葚低糖復合果醬工藝優化及風味、抗氧化活性變化分析

申光輝， 馮 孟， 張志清， 陳安均， 黎杉珊， 劉興艷

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

桑葚(FructusMori)是中國南北方廣泛栽培的一種重要的小漿果，口感酸甜，富含多酚、黃酮、花青素、胡蘿卜素等生物活性成分[1]，具有良好的抗氧化功能[2]，被譽為“第三代水果”。中國桑葚資源豐富，但因桑葚皮薄，含水含糖量高，成熟期較為集中，貯藏難度大，多以鮮食為主，精深加工利用技術相對滯后。果醬是桑葚等耐貯性差漿果的重要加工方式，對于增加產業鏈價值具有重要意義。目前國內桑葚果醬產品主要采用傳統果醬加工方式，產品種類單一，風味淡薄，含糖量高(≥60%)[3]，缺乏產品風味特色。

生香酵母是一類能夠產生酯類、醇類等多種揮發性香氣化合物的酵母菌，廣泛存在于白酒酒曲[4]、饅頭發酵劑[5]、泡菜、醬料[6]等傳統發酵食品中。利用生香酵母發酵可增加香氣成分種類與含量，是改善現代加工食品風味，提高產品品質的有效方式。除應用于醬油[7]、食醋[8]、饅頭[9]等傳統發酵食品，生香酵母越來越多的以強化發酵或混合發酵方式用于面包[10]、果汁果酒飲料[11-12]等現代加工食品風味品質的改善。王益姝等[10]利用異常威克漢姆酵母發酵面團提高了面包中異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等風味物質的含量。目前國內外利用生香酵母發酵桑葚果醬的研究鮮見報道。異常威克漢姆酵母Z133是分離自醬香型白酒酒曲的1株產香酵母，能夠代謝產生苯乙醇等香氣物質[13]。為改善傳統桑葚果醬風味品質，本研究以桑葚為原材料，以富含VC、礦物質等多種營養成分的番茄和胡蘿卜為輔料，以生香酵母Z133為菌株，優化其發酵低糖桑葚復合果醬的工藝條件，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜法(SPME-GC-MS)分析發酵工藝過程中揮發性成分的變化，并分析發酵對果醬基本理化指標、有機酸組成、抗氧化成分及其體外抗氧化活性的影響，為利用生香酵母加工發酵型桑葚果醬提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大十果桑采自四川省涼山州德昌縣，番茄、胡蘿卜購自本地農貿市場。

蔗糖購自本地超市，檸檬酸、黃原膠、低甲氧基果膠(LMP)、氯化鈣(食品級)均購自河南千志商貿有限公司。

生香酵母：異常威克漢姆酵母(WickerhamomycesanomalusZ133)，分離自醬香酒曲[13]。

1.2 主要試劑與儀器

苯乙醇(分析純≥99.0%)，上海瑞永生物科技有限公司產品；色譜甲醇，Oceanpak公司產品。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、葡萄糖、抗壞血酸(VC)、蘆丁(蕓香苷)等均為國產分析純。

100 型膠體磨，鄭州玉祥公司產品；WZS-1型阿貝折光儀，上海光學儀器廠產品；pHS-320型酸度計，成都世紀方舟公司產品；ZWY-2102C型恒溫培養震蕩器，上海智城分析儀器公司產品；LC-6A 型高效液相色譜儀(配SPD-10A紫外檢測器)，日本島津公司產品；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司產品；ICS-1100型離子色譜儀(配RFC-30型淋洗液自動發生裝置)，美國Thermo公司產品。

1.3 方法

1.3.1 發酵果醬制備工藝流程與要點 生香酵母活化→梯度馴化→原料打漿→復合果漿→殺菌→接種發酵→發酵果漿→調配濃縮→成品。

1.3.1.1 復合果漿制備 將符合原料要求的新鮮桑葚、番茄、胡蘿卜分別蒸汽漂燙軟化后打漿，其中桑葚漂燙3 min后打漿，番茄十字形切4塊漂燙4 min后打漿，胡蘿卜切0.5 cm厚片漂燙8 min，按0.5 ml/g加水打漿。根據混料試驗結果，將各原料果漿按質量比桑葚∶番茄∶胡蘿卜=73∶10∶17(質量比)混勻，100 ℃沸水浴殺菌20 min，冷卻備用。

1.3.1.2 生香酵母菌梯度馴化培養 將活化酵母菌依次接種于復合果漿含量為25%、50%、75%和100%的馴化培養基，每梯度于28 ℃ 140 r/min振蕩培養20 h，使菌株逐步適應復合果漿營養條件，活菌數大于 1.0×108CFU/ml。

1.3.1.3 生香酵母菌發酵 將梯度馴化的發酵種子液接種于150 ml復合果漿中，添加蔗糖靜置發酵。

1.3.1.4 果漿調配與醬體濃縮 向發酵后的150 ml果漿中添加28 g蔗糖，檸檬酸調整pH值至3.6，50 ℃真空預濃縮至100 ml左右(接近濃縮終點)，再依次添加0.04 g氯化鈣，0.5 g低甲氧基果膠和0.5 g黃原膠，濃縮至100 g即為果醬產品。

1.3.2 復合果漿發酵條件優化 采用單因素試驗考察生香酵母菌接種量、發酵溫度、發酵時間和蔗糖添加量4個因素對發酵果漿感官綜合評分和苯乙醇含量的影響。其中接種量設103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml，發酵溫度設24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，發酵時間設12 h、16 h、20 h、24 h、28 h，蔗糖添加量設2%、4%、6%、8%、10%。各因素固定水平分別為接種量105CFU/ml，發酵溫度28 ℃，發酵時間20 h，蔗糖添加量6%。

在單因素試驗結果基礎上，采用L9(34)正交試驗，以最終制備的果醬感官模糊數學綜合評分為指標，同時結合果醬苯乙醇含量，對影響發酵的3個主要因素(接種量、發酵時間、蔗糖添加量)進行優化，試驗水平見表1。

表1 生香酵母發酵復合果漿L9(34)正交試驗因素水平

表2 生香酵母發酵果醬感官評定等級標準

1.3.4 發酵果醬苯乙醇含量測定 采用反相高效液相色譜法[16]。取2.00 g果醬樣品加水稀釋定容至50 ml，8 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾。Phenomenex Luna-C18(2)色譜柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm)，流動相比例甲醇∶水(體積比)=50∶50，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，進樣量10 μl，流速1.0 ml/min。峰面積外標法進行定量。

1.3.5 發酵果醬制備過程中揮發性成分分析 采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法測定原料果漿、發酵果漿、發酵果醬和非發酵果醬樣品的揮發性成分[17]。頂空固相微萃取條件：取5.00 g果醬于15 ml采樣瓶中，按質量濃度0.1 g/ml 加入NaCl，超聲10 min，插入裝有固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)的手動進樣器，60 ℃萃取30 min，快速移出并插入進樣口，250 ℃熱解析3 min，不分流進樣。色譜條件：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱,進樣口溫度250 ℃，高純He流量1 ml/min。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至190 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍33～550 amu，接口溫度為250 ℃。對采集到的質譜圖利用NIST 11.L譜圖庫進行檢索，根據匹配度來確定未知化合物，當SI>80%時定性，并結合保留指數法予以確認，剔除萃取頭及色譜柱流失成分，采用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

通過計算相對氣味活度(ROAV)比較不同果醬樣品的揮發性風味成分對果醬風味貢獻的大小。所有組分0≤ROAV≤100，ROAV越大的組分對樣品總體風味的貢獻就越大，其中ROAV≥1的組分對樣品總體風味起特征性決定作用，視為關鍵風味化合物，而0.1≤ROAV<1.0的組分對樣品總體風味具有重要的修飾作用，認為其對風味具有重要貢獻[18]。

1.3.6 有機酸含量測定 采用離子色譜法[19]，按峰面積外標法定量。IonPac AS18(4 mm×250 mm)陰離子交換分析柱，AG18保護柱(4 mm×50 mm)；KOH梯度洗脫條件：0～13 min 2 mmol/L，13～30 min 2～45 mmol/L，30～45 min 45 mmol/L，45～50 min 45～2 mmol/L；流速1.0 ml/min；進樣體積25 μl，柱溫30 ℃，色譜池溫度35 ℃，抑制電流112.5 mA。樣品用超純水稀釋100倍，依次過SPE-RP柱和SPE-Ag柱，棄初始3 ml后經0.22 μm濾膜過濾，上機分析。

1.3.7 果醬基本指標測定 可溶性固形物采用阿貝折光儀測定，以20 ℃樣品折光率計；總糖采用硫酸-蒽酮比色法[20]測定；總酸測定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[21]；pH值采用酸度計測定。

1.3.8 抗氧化成分含量及體外抗氧化活性測定 總黃酮含量采用NaNO2-AlCl3比色法[22]測定，總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[23]測定，VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法[20]測定，花青素含量采用pH示差法[24]測定。

DPPH·清除能力的測定參考Sharma等[25]的方法，·OH清除能力測定參考晁正等[26]的方法，總還原力采用鐵離子還原能力[27]測定。

2 結果與分析

2.1 復合果漿發酵單因素試驗結果

生香酵母發酵能夠賦予發酵原料特殊香氣，改善產品風味[13]。異常威克漢姆酵母Z133具有產生多種醇、酯類香氣成分的能力，特別是玫瑰花香氣的苯乙醇。本試驗考察生香酵母接種量、發酵溫度、發酵時間和蔗糖添加量4個單因素對果醬感官品質和苯乙醇含量的影響。

2.1.1 接種量 由圖1可見，不同接種量對生香酵母發酵果醬感官綜合評分和苯乙醇含量具有明顯影響。接種量過低，發酵產香效應尚未表現出來，感官綜合評分較低，當接種量過高，發酵速度快，特別是當接種量超過1×105CFU/ml，發酵產生較濃厚的花香氣味和酸味，掩蓋桑葚的果香氣味，導致感官綜合評價明顯降低，接種量1×105CFU/ml時，感官品質最好。生香酵母發酵產生玫瑰花香味的苯乙醇含量隨著接種量增加而不斷提高。

圖1 接種量對發酵果醬感官綜合評分與苯乙醇含量的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on sensory scores and phenylethanol content of fermented jam

2.1.2 發酵溫度 由圖2可以看出，發酵溫度對果醬感官綜合評分具有一定的影響，但對苯乙醇含量影響并不顯著。發酵溫度28 ℃時，感官綜合評分最高，為85分，而發酵溫度過低，香氣成分產生速度較慢，發酵溫度過高，利于酒精發酵，均導致感官綜合評分降低。

圖2 發酵溫度對發酵果醬感官綜合評分與苯乙醇含量的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on sensory scores and phenylethanol content of fermented jam

2.1.3 發酵時間 發酵時間對生香酵母代謝產生各類風味物質具有重要影響。由圖3可見，發酵時間對果醬感官風味和苯乙醇均有明顯影響。當發酵時間為20 h時，復合果醬感官綜合評分最高為88.3分，隨著發酵時間的延長，產生更多的乙醇，掩蓋了原料本身的風味，感官綜合評分急劇降低。苯乙醇含量隨著發酵時間延長不斷升高。

圖3 發酵時間對發酵果醬感官綜合評分與苯乙醇含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on sensory scores and phenylethanol content of fermented jam

2.1.4 蔗糖添加量 添加外源蔗糖作為生香酵母碳源，可促進酵母生長代謝。由圖4可見，添加6%蔗糖進行發酵所得果醬感官綜合評分最高，蔗糖添加過量，導致生香酵母發酵過度，掩蓋果漿原來的風味。但苯乙醇含量隨著蔗糖添加量增加不斷提高，表明蔗糖利于苯乙醇的積累。

圖4 蔗糖添加量對發酵果醬感官綜合評分與苯乙醇含量的影響Fig.4 Effects of the amount of sugar on sensory scores and phenylethanol content of fermented jam

2.2 復合果漿發酵正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，采用L9(34)正交試驗，以不同發酵條件制備的果醬感官綜合評分(Y1)及苯乙醇含量(Y2)為指標，選取對感官綜合評分和苯乙醇含量具有顯著影響的接種量、發酵時間、蔗糖添加量，確定最佳發酵條件。由表3極差分析結果可知，各影響因素對發酵果醬感官綜合評分及苯乙醇含量的影響主次順序均為：接種量>發酵時間>蔗糖添加量。由表4結果可知，發酵時間和接種量對果醬感官綜合評分及苯乙醇含量的影響均達到顯著水平(P<0.05)，而蔗糖添加量對其影響均不顯著(P>0.05)；由表3可知，正交試驗結果顯示，以果醬感官綜合評分為指標的最佳工藝條件為試驗組5：接種量1×105CFU/ml、發酵時間20 h、蔗糖添加量8%，感官綜合評分為86.50。苯乙醇含量最高為試驗組9：接種量1×106CFU/ml、發酵時間24 h、蔗糖添加量6%，苯乙醇含量為3.05 μg/g。果醬風味是多種揮發性化合物的綜合體現，因此，苯乙醇含量僅可作為發酵工藝優化的參考指標。基于原料成本角度結合感官綜合評分結果，確定復合果漿的最佳發酵條件為接種量1×105CFU/ml、發酵時間20 h、蔗糖添加量4%。在此條件下進行驗證試驗，所得發酵果醬感官綜合評分為86.82，苯乙醇含量為2.83 μg/g，均接近于試驗組最佳組合發酵果醬樣品值。

2.3 發酵果醬加工過程中揮發性物質變化分析

果醬風味與其中的烯類、醇類、醛類、酸類、芳香族化合物密切相關。果醬熱加工過程中部分小分子香氣成分會逸散或降解損失而導致風味變化[28]。本試驗通過HP-SPME-GC-MS方法對原料復合果漿、發酵果漿、發酵果醬及非發酵工藝制備的果醬各類揮發性物質種類和相對含量進行檢測分析。由表5可見，復合果漿原料中檢測出15種揮發性成分，以烯類和酯類為主，其中烯類6種，酯類8種，醛類1種，醇酮類等成分未檢出，原料中烯類以角鯊烯(3.559%)、檸檬烯(0.822%)、γ萜品烯(0.399%)的相對含量較高，酯類以反式油酸甲酯(37.674%)、硬脂酸甲酯(4.862%)和花生酸甲酯(3.640%)等脂肪酸酯類化合物相對含量較高。復合果漿檢出揮發性物質種類較少，可能與原料漂燙、打漿處理過程中熱處理破壞損失有關。

表3 復合果漿生香酵母發酵L9(34)正交試驗結果表

R1j、R2j分別表示感官綜合評分、苯乙醇含量的極差值。

表4 正交試驗方差分析結果

復合果漿經過生香酵母發酵轉化，揮發性物質種類和含量產生了明顯變化，通過生香酵母發酵新增加了具有果香味的苯乙烯、芳樟醇2種烯類化合物和具有玫瑰花香的苯乙醇，此外還生成了細辛脂素；同時通過生香酵母代謝利用，使復合果漿中的α-蒎烯、檸檬烯、α-石竹烯和γ萜品烯相對含量降低。此外，生香酵母發酵新生成了辛酸乙酯等9種酯類化合物，而原料中有3種酯類化合物可能通過酶反應被代謝，而在發酵果漿中未被檢出。

濃縮工藝是制備果醬的關鍵環節，真空濃縮可有效降低濃縮物料溫度，避免高溫對果蔬類產品揮發性成分及營養成分的破壞。由表5可見，采用生香酵母發酵果漿濃縮而成的果醬與非發酵果醬產品揮發性成分種類組成差異明顯。濃縮導致發酵果醬和非發酵果醬中烯類物質種類數均明顯減少，采用真空濃縮在提高果蔬汁固形物含量的同時，仍無法避免果蔬汁風味物質種類及含量的變化[29-30]。濃縮對2種不同工藝果醬酯類化合物種類影響不同，其中發酵果醬濃縮后3種原有酯類物質被破壞，同時新生成了6種酯類化合物，總體增加了3種，而非發酵果醬中原有4種酯類化合物未被檢出，同時新增了2種，總體上減少了2種。發酵果醬濃縮反應能夠新生成更多的酯類化合物，可能與生香酵母發酵提供更多的酯類前體物質有關。除苯乙醇和棕櫚酸外，發酵果醬較非發酵果醬多11種酯類化合物。因此，生香酵母發酵可賦予桑葚復合果漿更多的醇、酯類香氣成分，對產品風味起到一定改善作用。

表5 生香酵母發酵低糖桑葚復合果醬加工過程揮發性成分變化

“-”表示未檢測出。

食品特征風味不僅受揮發性風味成分相對含量影響，同時與關鍵風味物質感覺閾值有關。由表6可知，4種不同樣品的關鍵風味物質的種類、數量差異較大。其中檸檬烯和壬醛閾值較低(分別為0.210 0 mg/kg和0.015 0 mg/kg)，是原料果漿及2種果醬成品的關鍵特征性風味物質。復合果漿中壬醛、檸檬烯、α-石竹烯ROAV均大于1，是原料中的關鍵特征性風味化合物。復合果漿經生香酵母發酵后的發酵果漿重要風味物質種類數大大增加，其中芳樟醇對總體風味貢獻最大(ROAV=100)，此外發酵產生的苯乙烯ROAV為13.27，表明發酵產生甜香氣味的苯乙烯對原料風味特征具有重要影響。經過濃縮后的2種果醬樣品中重要風味物質種類數均有所減少，特別是生香酵母發酵產生的苯乙烯、芳樟醇并未得到較好的保留，但發酵果醬中的γ萜品烯、辛酸乙酯和苯乙醇對果醬風味產生了重要修飾作用(ROAV均大于0.1)，表明生香酵母發酵能夠有效改善桑葚復合果醬的風味。

表6 不同樣品關鍵風味物質氣味閾值、氣味特征及ROAV

“-”表示未檢測出。

2.4 發酵果醬與非發酵果醬品質比較

為比較生香酵母發酵制備的復合果醬與非發酵果醬的相關品質及抗氧化能力的差異，試驗以未經發酵直接以相同工藝條件調配濃縮制備的非發酵果醬為對照，分析相關指標的異同。

由表7可知，生香酵母發酵工藝制備的果醬和非發酵果醬基本指標差異顯著。生香酵母發酵將糖類物質轉化成有機酸，而使發酵果醬糖度和可溶性固形物含量顯著低于非發酵果醬(P<0.05)，酸度顯著高于非發酵果醬(P<0.05)。發酵果醬乳酸、乙酸、甲酸和草酸含量均顯著高于非發酵果醬，而琥珀酸含量顯著低于非發酵果醬(P<0.05)。檸檬酸主要通過預濃縮階段添加，生香酵母發酵的果漿酸度更高，因此用于調整pH的檸檬酸添加量略少，而導致最終發酵果醬中檸檬酸含量較低。不同有機酸具有不同的風味特征，乳酸可增強濃厚感，蘋果酸酸味圓潤，呈味緩慢持久，乙酸和草酸酸味強度高，感官刺激性強，而琥珀酸呈辣味[32]。因此經過生香酵母發酵改變果醬有機酸含量，使其口感更醇厚協調。

酚類、黃酮和花青素是桑葚、胡蘿卜等原料重要的抗氧化活性成分。酵母發酵對原料抗氧化成分及其活性具有重要影響[33-34]。由表7可知，與非發酵果醬相比，發酵果醬中總黃酮和總酚無顯著性變化(P>0.05)，VC含量略有降低，但差異并不顯著(P>0.05)，而花青素含量顯著高于非發酵果醬(P<0.05)。體外抗氧化活性結果表明，發酵果醬DPPH·清除率和總還原能力與非發酵果醬無顯著性差異(P>0.05)，但發酵果醬·OH清除率顯著高于非發酵果醬(P<0.05)。因此，生香酵母發酵可一定程度上提升果醬抗氧化功能。

表7 發酵與非發酵果醬基本指標、有機酸、抗氧化成分及體外抗氧化活性差異

同一行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)。

3 結 論

本研究利用異常威克漢姆酵母Z133發酵，真空濃縮制備發酵型桑葚低糖復合果醬。通過優化試驗獲得了酵母發酵桑葚復合果漿的最佳條件：接種量 1×105CFU/ml、發酵時間20 h、蔗糖添加量4%。所制備果醬糖度36.02%，可溶性固形物40.15%，pH3.32，風味協調，醇酯香味濃郁，感官綜合評分86.82，苯乙醇含量為2.83 μg/g。檢測結果表明，通過生香酵母發酵可使復合果漿原料新增苯乙烯、芳樟醇、苯乙醇和辛酸乙酯等7種酯類香氣物質，最終發酵果醬中較非發酵果醬增加了γ萜品烯、辛酸乙酯和苯乙醇，提高了乳酸、乙酸、甲酸和草酸含量，改善了桑葚復合果醬的風味品質，同時保留了更多花青素，提高了·OH清除能力。

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