玫瑰黃酮醇合成酶FLS基因的克隆及生物信息學分析

李忠健 ，張鵬遠 ，靳金粉 ，趙蘭勇 *，徐宗大 *

（1.山東農業大學林學院，山東 泰安 271018；2.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟南 250000）

玫瑰屬于薔薇科薔薇屬，花形優美，花香四溢，耐寒抗旱，便于管理?；ㄉ鳛槊倒逡环N主要觀賞特性，直接影響其觀賞價值。類黃酮途徑是玫瑰花色形成的主要途徑[1]，黃酮醇合成酶基因（FLS）是該途徑中關鍵基因之一，它的表達量多少直接影響著花色的形成[2-3]。

Holton等[4]利用PCR技術首次從矮牽牛中克隆出黃酮醇合成酶基因，之后FLS在苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）[5]、 煙草 （Nicotiana tabacun）[6]、 茶樹（Camellia sinensis）[7]、金銀花（Lonicera japonica）[8]等多種植物成功被克隆，其蛋白結構也已明確。在此基礎上，FLS基因開始通過基因工程應用于花色基因的改良工作，Zhou等[9]將金花茶的FLS基因在煙草中過量表達后，煙草花色轉變為白色和黃色，并且花色苷成分明顯減少，黃酮醇明顯增加，進一步說明該基因是在類黃酮途徑中的重要基因。

玫瑰花色多以紫色為主，也有少量粉色、白色品種，但是缺乏黃色、橙色等品種[10]，花色的單一嚴重限制了玫瑰作為觀賞植物的應用。目前雜交育種的手段是改良玫瑰花色的主要方法，而很少利用基因工程，因此怎樣通過基因工程改良玫瑰花色可作為今后培育玫瑰新品種的一個新的研究方向。FLS基因作為玫瑰花色合成途徑上的關鍵基因之一，本研究將其在玫瑰花瓣中分離并分析，對今后玫瑰花色的改良有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間地點

2016年于山東農業大學林學院花卉研究所進行試驗。

1.2 植物材料

所用植物為山東農業大學玫瑰種質資源圃內的玫瑰野生類型 ‘琿春’（Rosa rugosa‘Hunchun’），2016年4月至5月中旬采摘初開期花瓣，迅速放入液氮中，然后保存于-80℃冰箱中。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因克隆

采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取‘琿春’花瓣的總RNA，1.0%的非變性瓊脂糖進行凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用Nanodrop2000C微量分光光度檢測RNA的純度和濃度。檢測合格的RNA參照反轉錄試劑盒5X ALL-In-One RT MasterMix說明書合成cDNA第一鏈。參照本實驗室已有的玫瑰花瓣轉錄組測序結果，設計該FLS基因特異性引物：上游引物 RrFLS：5’-ATGGGGGTAGAGAGAGTTC-3’；下游 引 物 RrFLSR：5’-AGATGGCCAGTGGTACGAT-3’，引物合成由上海生物工程有限公司進行。

以cDNA作為模板，用設計的特異性引物擴增該基因的目的片段。PCR反應體系為：滅菌ddH2O 9.5uL、2×EasyTaqSuperMix 12.5μL、目的基因上下游引物各 1μL、模板 cDNA 1uL，共 25μL。 反應條件為：94℃預變性 5min；94℃變性 1min，55℃退火 45s，72℃延伸 1min，35個循環，72℃保溫 10min。 用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的PCR產物。根據Magen膠回收試劑盒說明書將目的條帶進行回收，與TaKaRa的PMD18-T載體進行連接，轉化大腸桿菌，進行PCR鑒定后挑選陽性克隆進行測序。

3‘RACE擴增根據測序得到的玫瑰FLS基因片段序列，設計巢式PCR所需特異性引物：RrFLS-1：5’-TGCTCTTGGTGTGGTTGC-3’；RrFLS-2：5’-AGATGGCCAGTGGTACGAT-3’；B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。

以cDNA為模板，用巢式PCR特異性引物進行3’端擴增。第一輪PCR：用RrFLS-1和B26做第一輪PCR引物，反應體系同上，反應條件為94℃預變性 5min；94℃ 變 性 1min，55℃ 退 火 30s，72℃ 延 伸45s，35 個循環，72℃保溫 10min。 第二輪 PCR：將第一輪產物稀釋100、500、700倍作為模板，RrFLS-2和B26做第二輪PCR引物，反應體系同上，反應條件為 94℃預變性 5min；94℃變性 1min，55℃退火30s，72℃延伸 45s，35 個循環，72℃保溫 10min。 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的PCR產物。根據Magen膠回收試劑盒說明書將目的條帶進行回收，與TaKaRa的PMD18-T載體進行連接，轉化大腸桿菌，進行PCR鑒定后挑選陽性克隆進行測序。

1.3.2 生物信息學分析

借助NCBI提供的在線Blast進行同源序列的比對；利用DNAMAN對該蛋白與其他植物蛋白進行多重比對分析；利用ExPasy服務器中在線軟件ProtParam預測RrFLS蛋白的基本理化性質；利用NCBI中的CD-Search功能預測目的基因的保守域；利用ORFFinder對RrFLS基因cDNA的開放閱讀框進行查找；利用在線軟件NetPhos3.1server、NetOGlyc4.0server和SignalP4.1，對目的基因編碼蛋白磷酸化位點、糖基化位點和信號肽進行預測；利用在線軟件TMpred軟件預測RrFLS蛋白的跨膜結構域；利用在線軟件SOPMA對目的基因編碼的蛋白進行二級結構預測；利用MEGA5.0構建FLS系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 RrFLS基因克隆結果

以玫瑰花瓣cDNA為模板，經過擴增測序得到741bp的RrFLS中間片段 （圖1），經過過3’RACE擴增后得到565bp的3’末端序列 （圖2），利用DNAstar對兩者經過拼接后得到1287bp的cDNA序列全長。利用DNAMAN對RrFLS的堿基序列進行分析，發現其包括完整的開放閱讀框（ORF），含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，具備長度為1008bp的完整閱讀框架(ORF)，有polyA尾巴，編碼335個氨基酸（圖3）。

2.2 RrFLS基因的生物信息學分析

2.2.1 RrFLS基因基本理化性質分析

圖1 中間片段的克隆Fig.1 Cloning of intermediate fragments

圖 2 3’RACE擴增Fig.2 3’RACE amplification

圖3 RrFLS的基因序列及其氨基酸序列Fig.3 RrFLS cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

根據ProtParam軟件對RrFLS蛋白的理化性質預測結果可以看出，RrFLS蛋白的相對分子質量為38018.54Da，理論等電點pI=5.85，該蛋白為酸性。該蛋白不穩定系數為34.10（＜40），所以可推測RrFLS蛋白為穩定蛋白。從ProtScale對RrFLS蛋白的疏水性預測結果可看出，RrFLS蛋白疏水性最大值為1.878，最小值為-2.967，平均疏水指數為-0.455，所以推測該蛋白偏親水。

圖4 RrFLS蛋白保守域預測Fig.4 Prcdicts conservative structure domain of RrFLS

根據NCBI的CD-Search功能的結果可以看出，RrFLS基因有一個含有96個氨基酸殘基的保守結構域，屬2OG-Fe(II)_oxy超級家族（圖4）

根據NetPhos 3.1 server的磷酸化位點預測結果可以看出，該蛋白存在8個Ser磷酸化位點，4個Thr磷酸化位點，8個Tyr磷酸化位點。磷酸化位點數量較多，可以說明在RrFLS蛋白中可逆磷酸化調控有重要作用。利用NetOGlyc4.0server預測關鍵結構基因編碼的蛋白質的O糖基化位點，可知在玫瑰FLS中含有3個O糖基化位點，分別位于氨基酸序列的第22位、26位和108位。利用SignalP4.1軟件對蛋白質序列信號肽進行分析，可以發現，沒有信號肽及其剪切位點在RrFLS基因編碼的蛋白中。

根據TMpred軟件對RrFLS蛋白的跨膜結構域預測結果可以看出，玫瑰RrFLS蛋白不具有跨膜結構域。

根據SOPMA軟件對RrLFS蛋白的二級結構分析結果可知，該蛋白由36.12%的α螺旋、33.13%的隨機卷曲、7.46%的β轉角和23.28%的延伸鏈組成（圖 5）。

圖5 RrFLS蛋白的二級結構圖Fig.5 Predication of secondary structure of RrFLS

2.2.2 蛋白序列同源性和進化樹分析

用DNAMAN軟件對包括玫瑰在內的7種植物的FLS蛋白氨基酸進行多重序列對比，從比對結果（圖6）可以看出，FLS在不同植物中保守性非常好，僅N端起始的1~19個氨基酸序列保守性比較差，表明不同物種的FLS的同源性非常高。

利用MEGA5，以包括玫瑰FLS在內的16種植物的氨基酸序列構建系統進化樹，可以看出，與玫瑰同科的植物親緣關系較近，玫瑰與桃最先聚合，說明在以下幾種植物中它與桃的親緣關系最近，與薔薇、草莓在聚合為一個亞類，說明玫瑰與薔薇、草莓也有非常近的親緣關系，與其他科的植物親緣關系相隨比較遠（圖7）。

3 討論

FLS基因是植物類黃酮物質合成途徑中非常重要的基因，可以催化二氫黃酮醇結構中的C3發生羥基化，形成黃酮醇類化合物[11-15]。因二氫黃酮醇為FLS基因和二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）基因的共同底物，所以黃酮醇以及花色苷的合成量與FLS基因表達量有直接聯系，因此FLS表達量的高低對花色形成也有重要影響。FLS作為影響花色形成的關鍵基因，已成功從多種植物分離出來。本研究運用RT-PCR和RACE技術將FLS基因成功從玫瑰花瓣中克隆出來，經生物信息學分析得到，RrFLS基因含1005bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸，其蛋白的分子式為C1731H2681N443O502S9，相對分子質量為38018.54Da，等電點pI為5.85。該蛋白不穩定系數

為34.10（＜40），為穩定蛋白，不存在信號肽和剪切位點。其蛋白質二級結構由36.12%α螺旋、33.13%隨機卷曲、7.46%β轉角和23.28%延伸鏈組成。

圖6 不同植物FLS蛋白氨基酸序列多重比對Fig.6 Multiple alignment of FLS amino acid sequences from different plants

圖7 RrFLS與其它物種FLS蛋白系統進化樹分析Fig.7 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid secquences of RrFLS and other FLS

RrFLS基因翻譯得到的氨基酸序列經NCBI中Blast比對發現，它與其他植物氨基酸序列同源性較高，為67%~99%，與同科植物桃相比相似程度可達到99%，與薔薇科許多植物相似度可以到90%以上，以上結果可以說明FLS基因在不同物種之間是相對比較保守的，與前人實驗結果相同[16]，可為不同科屬植物親緣關系的研究提供理論依據。

Nieslen等[17]利用基因沉默技術抑制FLS基因，使洋桔梗的花色由紫色變為紅色，并能穩定遺傳。Holton等[4]向煙草中導入反義FLS基因后，檢測發現花色苷含量明顯升高。以上實驗結果都證明了FLS基因可以影響花色的形成。本研究通過對玫瑰花瓣中FLS基因進行分離，并對其進行生物信息學分析，探明了RrFLS的信息，為今后玫瑰花色的改良提供了理論依據。

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