高效液相色譜法測定人血漿中左乙拉西坦的藥物濃度

蔡 樂，朱 英，張明華，陳靜靜，柴 棟（解放軍總醫院藥學部，北京 100853）

左乙拉西坦（levetiracetam，LEV）是一種吡咯烷酮衍生物，其化學結構與其他抗癲癇藥物無相關性。LEV的抗癲癇機制尚不明確，有研究[1]發現其可與突觸囊泡蛋白2A結合并抑制突觸前膜鈣通道，可能有選擇性地抑制癲癇樣突發放電的超同步性和癲癇發作傳播的作用。LEV可用于成人、兒童及一個月以上嬰幼兒癲癇部分性發作的加用治療。LEV具有良好的藥動學特性，其生物利用度高，蛋白結合率較低（＜ 10%），呈線性代謝特征，無肝酶誘導作用[2]。由于大部分LEV（約66%）以原型經腎臟排泄[3]，腎功能異常以及聯合使用主要經腎臟排泄的藥物可能會減慢其在體內的消除。因此對于特殊人群（如兒童、老年人、孕婦和腎功能不全患者）使用LEV后進行治療藥物監測可能有利于患者的個體化治療，提高患者用藥依從性。為此，本研究建立了人血漿中LEV的HPLC測定方法，旨為臨床優化LEV的給藥方案提供方法學基礎。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

左乙拉西坦對照品（S i g m a公司，批號：BCBS2739V），甲硝唑片（遠大醫藥有限公司，批號：170216）。乙腈為色譜純（Fisher公司），甲醇、二氯甲烷為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為實驗用超純水。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、色譜工作站，美國Agilent公司）；TGL16M型醫用離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海弛唐實業有限公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Thermo公司）；流動相：水-乙腈（87 : 13，v/v）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：205 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 樣品處理

2.2.1 血漿樣品處理方法精密吸取待測血漿400μL置于1.5 mL帶塞塑料離心試管，加入內標（200 μg·mL-1的甲硝唑溶液）50 μL，再加入600 μL乙腈，渦旋振蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min，轉移上清液900 μL于1.5 mL帶塞塑料離心試管；加入二氯甲烷400 μL，渦旋振蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min；吸取上清液200 μL于樣品瓶中（注意不要觸及下層有機相），20 μL進樣分析。

2.2.2 標準曲線的制備精密稱取左乙拉西坦對照品，用甲醇溶解配制成含左乙拉西坦為1.0 mg·mL-1的LEV儲備液；取適量LEV儲備液用空白血漿分別配制濃度為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 μg·mL-1的LEV血漿標準溶液。按“2.2.1”項下方法進行樣品處理和進樣測定。以濃度（C）為橫坐標，待測物與內標的峰高比（PHR）為縱坐標繪制標準曲線，并用SPSS統計軟件進行加權線性回歸計算。

2.2.3 質控樣品取適量LEV儲備液用空白血漿另行配制濃度為5.0、25.0和50.0 μg·mL-1三個濃度的質控樣品溶液。將質控樣品作為“未知樣品”隨機分散于血漿標準溶液和每批待測樣品中測定。以每次的標準曲線計算出質控樣品的濃度，以質控樣品的測定濃度與標示濃度的比值考核方法學的精密度、重現性和回收率。

2.3 精密度與準確度

取3個濃度的質控樣品各5份，組成一個分析批，按“2.2.1”項下方法處理后測定，計算批內RSD；連續3 d，運行3個分析批的質控樣品，考察批間RSD；各濃度質控樣品按未知樣品隨標準曲線同時測定，計算方法學回收率。

2.4 穩定性實驗

取3個濃度的質控樣品，置于– 20 ℃冰箱，經反復凍融3次，測定前放置室溫平衡后，按“2.2.1”項下方法進行樣品處理和進樣，以此考察樣品凍融穩定性；取質控樣品于室溫放置24 h，依“2.2.1”項下方法處理，考察樣品室溫放置穩定性；取質控樣品，依照“2.2.1”項下方法處理后室溫放置，于0、1、3、6、12、24 h測定，考察樣品處理后放置穩定性。

3 結果

3.1 色譜行為

由圖1可見，在205 nm波長下，樣品圖譜在LEV和內標出峰處背景干凈，無明顯雜峰干擾；LEV與內標峰形尖銳，與各雜峰分離良好。LEV與內標的保留時間分別為4.7 min和5.2 min。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

3.2 線性關系

在本方法條件下，LEV在2.5 ～ 80.0 μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系，線性方程為：PHR= 0.114 1C+ 0.115 3，r= 0.999 4。

3.3 精密度與方法學回收率

本方法的精密度和方法學回收率結果見表1，結果表明本方法的精密度和準確度良好。

表1 方法精密度和回收率實驗結果Tab 1 The precision and recovery results of the method

3.4 穩定性考察結果

穩定性結果表明，LEV質控樣品經反復凍融3次穩定性良好；LEV血漿樣品室溫放置24 h穩定；LEV血漿樣品處理后，室溫放置24 h穩定。

4 討論

4.1 測定方法與線性范圍的確定

文獻報道，LEV治療藥物監測的方法有多種，包括HPLC、HPLC-MS/MS、免疫分析法等[4-7]。目前國內尚無市售的免疫學試劑盒方法監測LEV血藥濃度，因HPLC的普及性較好，為此本研究建立了LEV的HPLC測定方法。有報道LEV的有效濃度范圍為12 ～46 μg·mL-1[2-3]，本研究將線性范圍設定為2.5 ～ 80.0 μg·mL-1，可涵蓋此濃度范圍，以滿足臨床日常監測LEV血藥濃度的需要。

4.2 流動相的選擇

本實驗考察了流動相溶液pH與乙腈比例對LEV保留時間和分離的影響，發現流動相中乙腈比例對LEV和內標甲硝唑保留時間的影響較大，隨著乙腈比例的升高，LEV和甲硝唑保留時間明顯縮短。流動相溶液pH值雖然對LEV和甲硝唑的保留時間影響不大，但由于血漿樣品中內源性物質的存在，使用磷酸鹽緩沖液和乙腈為流動相時，LEV和甲硝唑受到了雜峰的干擾。為提高檢測效率，縮短測定時間，經優化最終確定以水-乙腈（87 : 13，v/v）作為流動相。

4.3 樣品處理方法的選擇

文獻報道，LEV測定時可選用液-液萃取和蛋白沉淀的方法處理血漿樣品[5,8-9]。本實驗發現蛋白沉淀方法操作較為簡便、省時。在乙腈沉淀蛋白后，使用二氯甲烷或氯仿可將乙腈反提，除去脂溶性雜質，可進一步減少內源性雜質的干擾并提高方法的靈敏度。本實驗分別考察了二氯甲烷和氯仿反提取乙腈的效果，發現使用二氯甲烷優于氯仿。為此，本研究對原有蛋白沉淀處理方法進行改進，以乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷反提取去雜質的方法處理血漿樣品。

4.4 樣品穩定性的考察

本實驗穩定性考察結果表明，LEV在血漿中室溫放置24 h穩定，經反復凍融3次穩定性良好。有報道顯示LEV的全血樣品在體外可經酯酶水解[3]，因此提示臨床在采血后應盡快分離出LEV血漿樣品，以減少全血樣品水解而導致藥物濃度降低。

綜上，根據文獻和本實驗室客觀條件，本研究建立了靈敏度高、簡便易行的測定血漿中LEV的HPLC方法，為LEV血藥濃度監測提供方法學基礎，為臨床根據血藥濃度調整給藥方案，促進合理用藥提供依據。

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