黃芪多糖的提取、化學修飾和清除自由基作用

李清平，張海容

(忻州師范學院 生化分析技術研究所，山西 忻州 034000)

黃芪含香豆素、黃酮類化合物、皂甙及微量葉酸和數種維生素等[1]。味甘，微溫，具有補氣固表，托瘡生肌、利水的功效，主治氣血虛弱、自汗、久瀉脫肛、子宮脫垂、腎炎浮腫、蛋白尿、糖尿病、慢性潰瘍等癥。多糖[2]是天然高分子化合物，存在于各種植物、動物、和微生物組織中，具有許多重要和獨特的生理作用。自由基[3]是常見的生化反應的中間態物質,與機體許多功能障礙和疾病的發生密切相關.當人體內的自由基產生過度或清除過慢,就會加速機體的衰老過程，使各種細胞、器官受到損害，誘發各種疾病。DPPH·(二苯基苦肼基自由基)[4]在有機溶劑中是一種穩定的自由基,其孤對電子在517nm 附近有強吸收(顯深紫色)。當有機清除劑存在時，孤對電子被配對,吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性[5]。DPPH·法用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速(反應時間僅需30min 左右)、簡便、靈敏可行的方法。

1 實驗

1.1 儀器

XA-1型固體樣品粉碎機，金壇市榮華儀器制造有限公司；DZ-1A型真空干燥箱， 天津市泰斯特儀器有限公司；722S 可見分光光度計，上海青華科技儀器有限公司；RE-52旋轉式蒸發器，上海安亭電子儀器廠；AB204-N電子分析天平，Mettler―Toledo Group。

1.2 藥品

無水乙醇，分析純(天津市北原方正試劑廠)；95%乙醇，分析純(天津市化學試劑三廠);DPPH·，分析純(東京化成工業株式會社)；葡萄糖，分析純(新鄉市化學試劑廠)；正丁醇，分析純(天津市化學試劑三廠)；三氯甲烷，分析純(天津市化學試劑三廠)；異丙醇，分析純(天津市北辰方正制藥廠)；氫氧化鈉，分析純(天津市北辰方正制藥廠)；氯乙酸，分析純(天津市化學試劑三廠)；甲醇， 分析純(天津市化學試劑三廠)；黃芪(忻州惠康藥店)。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃芪多糖的提取

粗多糖的提取:稱100 g黃芪粉末，用十倍水在水浴中煮沸20 h，過濾后將殘渣再次加十倍水水浴中煮沸20 h，合并兩次濾液，用旋轉蒸發儀蒸發到200 mL；

純化：用Sevag法去蛋白兩次，至溶液分兩層，取水相，加入800mL的95%乙醇沉淀，真空干燥，得去蛋白黃芪多糖5.012 g，樣品呈褐色；

多糖分級：加熱水將多糖溶解，除去不溶物，上層清液用于分級。乙醇終濃度達到50%時離心，得沉淀即H1；上清液濃縮，沉淀即H2。

1.3.2 對黃芪多糖H1的化學修飾

稱取0.3 g多糖(H1)在8 mL異丙醇劇烈攪拌，形成漿狀。室溫下在30min內慢慢加入0. 8 mL 30%氫氧化鈉溶液，繼續攪拌1 h，然后在30min內加入0.36 g氯乙酸。混合液置于100 mL燒杯中，用濾紙包住，55℃烘箱中放置3.5 h，去除液體，在70%甲醇中邊攪拌邊加入90%乙酸，以中和過量的氫氧化鈉，得甲基化多糖。產物干燥后先用70%甲醇洗滌，再用絕對甲醇洗滌，在60℃干燥。

1.3.3 黃芪多糖對自由基的清除

DPPH·(二苯基苦肼基自由基)在有機溶劑中是一種穩定的長壽命自由基，其孤對電子在517nm附近有強吸收(顯深紫色)。當有清除劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性。DPPH·法用以評價抗氧化劑抗氧化活性是一種快速、簡便、靈敏可行的方法。

原理：一個大分子的穩定自由基抗氧化劑預期作用模式為：

AH + DPPH·→ DPPH-H +A·

依據DPPH·具有單電子，在517nm處有一強吸收(深紫色)，當自由基清除劑與其單電子配對使其逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。

步驟：分別取多糖溶液(1.2mg/mL)0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.5，2.0mL及2×10-4mol·L-1的DPPH·溶液加入同一10mL比色管中，搖勻，30min后用同濃度的提取液作參比，測定吸光度A樣品,同時用無水乙醇作參比，測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH液與2 mL無水乙醇混合后溶液的吸光度A對照，根據下面的公式計算清除率：

A對照—指加入DPPH·的自由基體系的吸光度值；A樣品—指加入不同提取液，DPPH·后自由基體系的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 黃芪多糖的提取及化學修飾

按照實驗方法1.3.1提取黃芪粗多糖: 得去蛋白黃芪多糖5.012 g，樣品呈褐色；熱水將多糖溶解，除去不溶物，上層清液用于分級。乙醇終濃度達到50%時離心，得沉淀即H1；上清液濃縮，沉淀即H2。再按照實驗方法1.3.2，稱取0.3 g多糖(H1)在8 mL異丙醇劇烈攪拌，形成漿狀。加入0.8 mL 30% 氫氧化鈉溶液，繼續攪拌1 h加入0.36 g氯乙酸。去除液體，加入90%乙酸，得修飾多糖。產物用70%甲醇洗滌，干燥，即得甲基化多糖0.56 g。

2.2 DPPH法測定黃芪多糖對自由基的清除作用

分別測定H1、H2和修飾多糖對自由基的清除率，并以葡萄糖溶液(1.2 mg/mL)的清除率為對照，結果如圖1。

實驗的結果表明，三種多糖相同體積時抗自由基能力：H2>甲基化>H1。它們對自由基的清除作用與其濃度呈正相關性，即隨濃度的逐漸增加，清除率也逐漸增大。在濃度小于0.6 mg/mL時，甲基化多糖與H1有交叉重疊部分，且甲基化多糖略大于H1。H2與甲基化多糖的清除效率小于葡萄糖，這是因為葡萄糖有較強的還原作用。多糖由于在分級純化過程中除去大部分糖肽、蛋白質(而這些成分一般具有較強的抗氧化性)，故總體清除效果變弱，但多糖其清除效果明一般優于維生素C、維生素E及黃酮類化合物，具有對自由基有明顯化學作用而又不易被氧化的特點。

圖1 H1、H2和甲基化多糖對DPPH自由基的清除率

3 結語與展望

黃芪多糖一般被用來制成注射液、口服液，但未見黃芪多糖修飾后藥用性能變化的報道。本文通過提取黃芪多糖，以及對提取的多糖純化、分級和修飾來全面研究黃芪多糖的藥用價值。眾所周知，各種中草藥中含有多種抗氧化劑，天然抗氧化劑的應用在營養品、化妝品和醫藥及食品添加劑等方面都取得了可喜的進展，展示出廣闊的應用前景，隨著自由基和天然抗氧化劑研究的深入，天然抗氧化劑必將為人類的健康作出巨大貢獻。而多糖由于其自身的特點更是倍受關注，做為一種方便制備的天然抗氧化劑將被作為重要資源而有廣闊前景。

[1]張杰生,張童茜,安 宏.黃芪在心血管疾病治療中的應用進展[J].中醫研究,2012,25(8):78-80.

[2]吳 梅,譚 睿.黃芪多糖研究進展[J].川北醫學院學報,2013,28(1):17-20.

[3]聶 挺.量子化學計算研究多酚及多肽清除自由基的構效關系[D].南昌:南昌大學,2016.

[4]李鉉軍,崔勝云.抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機理[J].食品科學,2011(32):86-90.

[5]羅秋水,杜華英,熊建華,等.葛根異黃酮類化合物提取工藝優化及其抗氧化活性研究[J].中國食品學報,2015,15(2):104-110.