黑曲霉C2J6脂肪酶的保存穩(wěn)定性研究

蘇雪林，董佩娜，萬銀松，劉 婭*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

脂肪酶具有多項(xiàng)催化反應(yīng)（如催化水解、醇解、酯交換、酯合成等）能力[1]，是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，在食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而酶在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、應(yīng)用等過程中極易受溫度、pH值、脂肪酶濃度、底物濃度、酶的激活劑和抑制劑等多種因素的影響[2-3]，導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性差、易失活，限制了其有效應(yīng)用。因此，研究和改善穩(wěn)定脂肪酶的方法具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

目前，提高酶類保存穩(wěn)定性的方法主要包括三種，第一，酶的固定化[4-5]：將游離酶限定在一定空間內(nèi)或附著在某些固態(tài)物質(zhì)上。此法有效、便捷，且具有易于實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的分離、提高酶的使用效率和降低生產(chǎn)成本的優(yōu)點(diǎn)。第二，添加穩(wěn)定劑[6-9]：通過向酶液中添加底物、底物類似物、防腐劑、鹽類、糖類、多元醇類等化學(xué)物質(zhì)改善酶存在的環(huán)境。第三，蛋白質(zhì)工程技術(shù)[10-11]，利用分子手段和DNA重組技術(shù)定向改造酶的某些性質(zhì)，例如敲除不利于酶分子穩(wěn)定性的基因、添加有利的基團(tuán)等。此外，定向篩選、改變酶的保存溫度及利用化學(xué)修飾等方法也能有效增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性[12-14]。

鑒于添加穩(wěn)定劑的方法具有簡單、方便、成本低、易于操作，且酶活穩(wěn)定效果好的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)探討了室溫下黑曲霉（Aspergillusniger）C2J6脂肪酶在不同穩(wěn)定劑作用下的保存穩(wěn)定性，以期為其長期儲(chǔ)存奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6：本實(shí)驗(yàn)室自主分離、保藏的菌種。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯葡萄糖水26 g/L，瓊脂20 g/L；

液體種子培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L；

發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4Cl 15 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl20.1 g/L，KCl 0.5 g/L，橄欖油20 mL/L。

棕櫚酸對(duì)硝基苯酯：美國Sigma公司；聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）2000：天津永晟精細(xì)化工有限公司；橄欖油：上海嘉里食品工業(yè)有限公司；蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖水：青島海博生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、檸檬酸、醋酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、果糖、蔗糖、葡萄糖、丙三醇、硫酸鎂、氯化鈣、氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等（均為分析純）：北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；HH-42恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MJX-150智能霉菌培養(yǎng)箱、THZ-98恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海百典儀器有限公司；EON多功能酶標(biāo)儀：美國BIOTEK儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉C2J6脂肪酶的制備

黑曲霉C2J6經(jīng)液體種子培養(yǎng)22 h后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃條件下150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液過濾后即得脂肪酶粗酶液。

1.3.2 脂肪酶活力測(cè)定

將樣品管中各加入200 μL棕櫚酸對(duì)硝基苯酯反應(yīng)底物，40℃水浴預(yù)熱5 min，然后在樣品管中加入脂肪酶液50 μL，對(duì)照管中加入滅活的酶液50 μL，立即混勻計(jì)時(shí)，在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，加入10 μL乙二胺四乙酸二鈉溶液并放入冰水中10min終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長405nm處的吸光度值[16-17]。以未經(jīng)處理的脂肪酶初始活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.3 單一穩(wěn)定劑對(duì)脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響

（1）穩(wěn)定劑種類的影響

將0.2 mol/L醋酸鈉、3 mol/L丙三醇、4 mol/L氯化鈉、4 mol/L氯化銨、4%果糖、4%蔗糖、4%葡萄糖、0.2 mol/L硫酸鎂、0.2 mol/L聚乙二醇等穩(wěn)定劑分別添加到酶液中[18-21]，充分混勻后室溫放置48 h，測(cè)定相對(duì)酶活。

（2）穩(wěn)定劑添加量的影響

將不同添加量的丙三醇、聚乙二醇、氯化鈉、氯化銨、硫酸鎂、果糖、蔗糖、葡萄糖分別添加到酶液中，充分混合后室溫放置48 h，測(cè)定相對(duì)酶活。

1.3.4 復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取單一穩(wěn)定劑中3個(gè)保存效果較好的穩(wěn)定劑進(jìn)行復(fù)配，優(yōu)化各穩(wěn)定劑添加量。本試驗(yàn)以丙三醇添加量（A）、硫酸鎂添加量（B）、果糖添加量（C）為主要評(píng)價(jià)因素，相對(duì)酶活（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定劑種類對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

向脂肪酶中添加各種單一穩(wěn)定劑，考察穩(wěn)定劑對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，穩(wěn)定劑中丙三醇的效果最好，相對(duì)酶活高達(dá)63%以上，醋酸鈉的效果最差，相對(duì)酶活僅為22%左右。氯化鈉、硫酸鎂等其他穩(wěn)定劑均能在一定程度上保留脂肪酶活性。多元醇類穩(wěn)定劑屬于羥基化合物，其羥基可以和酶的酰胺基反應(yīng)，有研究表明酰胺鍵的形成能增強(qiáng)酶分子穩(wěn)定性，從而提高酶活力[22]。此外醇類穩(wěn)定劑中的丙三醇能增大酶液黏度，增加分子表面水化層，減少肽鏈間的碰撞，抑制酶分子間聚集，從而保護(hù)酶分子二級(jí)結(jié)構(gòu)、維持酶分子天然構(gòu)象，提高酶穩(wěn)定性[23]。糖類的羥基也可與酶液相互作用，使酶與水之間溶劑化，二者間形成的氫鍵能改變酶分子折疊的驅(qū)動(dòng)力，降低酶分子自由能，使酶分子穩(wěn)定性增強(qiáng)[24]。鹽類穩(wěn)定劑中金屬離子能結(jié)合酶的帶電基團(tuán)，減少氧氣等其他物質(zhì)和酶分子的結(jié)合，從而增加其穩(wěn)定性[25-26]。

圖1 穩(wěn)定劑種類對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of stabilizer type on lipase stability

2.2 穩(wěn)定劑添加量對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

從醇類、糖類、鹽類中挑選效果相對(duì)較好的穩(wěn)定劑，以不同濃度醇類和鹽類1～5 mol/L（硫酸鎂0.1～0.5 mol/L），糖類1%～5%，添加到脂肪酶中，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，隨著醇類添加量的逐漸升高，聚乙二醇對(duì)脂肪酶活力的影響不大，相對(duì)酶活僅維持在60%左右，而在4mol/L丙三醇作用下，相對(duì)酶活最高能達(dá)到63%左右?？梢姳嫉男Ч詢?yōu)于聚乙二醇。由圖2B可知，相同濃度下，硫酸鎂能較好的維持脂肪酶的活力，且在較低濃度下就能達(dá)到比較好的保存效果，0.2 mol/L硫酸鎂能使酶的相對(duì)活力達(dá)到60%以上。氯化鈉和氯化銨在低濃度時(shí)對(duì)酶的保存效果不佳，在濃度達(dá)到4 mol/L時(shí)的效果也沒有硫酸鎂好。由圖2C可知，隨著糖類穩(wěn)定劑添加量的不斷增大，脂肪酶的相對(duì)酶活逐漸增大至55%以上，其中在4%果糖作用下，能達(dá)到60%以上。但糖類濃度達(dá)到5%時(shí)，相對(duì)酶活則迅速減小。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，三種糖類穩(wěn)定劑對(duì)脂肪酶保存穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，其原因可能是低濃度的糖更容易與水分子相互作用，穩(wěn)定酶分子結(jié)構(gòu)，而高濃度的糖會(huì)使酶液滲透壓增大，改變酶分子構(gòu)象從而導(dǎo)致酶活降低。結(jié)果表明，4%的果糖作為穩(wěn)定劑能使脂肪酶的保存穩(wěn)定性更好。

圖2 醇類（A）、鹽類（B）、糖類（C）添加量對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of alcohol(A),salts(B)and sugar(C)addition on lipase stability

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

根據(jù)脂肪酶相對(duì)酶活的變化，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2和表3所示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，以丙三醇添加量（A）、硫酸鎂添加量（B）、果糖添加量（C）為自變量，以脂肪酶相對(duì)酶活（Y）為因變量，得到回歸方程：

由表3可知，在方差分析中，決定系數(shù)R2=0.982 6，表明了丙三醇添加量、硫酸鎂添加量、果糖添加量這三個(gè)因素與脂肪酶酶活的關(guān)系可以較好的用回歸方程進(jìn)行擬合。校正系數(shù)R2Adj=0.960 3，表明響應(yīng)值96%的變化可以用該模型解釋。模型項(xiàng)P＜0.000 1，差異極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，差異不顯著，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的差異都極顯著，說明非實(shí)驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響不大，該模型可以用于優(yōu)化穩(wěn)定劑保存脂肪酶的條件研究。

表2 脂肪酶穩(wěn)定劑配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for lipase stabilizer formula optimization

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

2.4 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為了更直觀的探討各穩(wěn)定劑對(duì)黑曲霉C2J6脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響且找到最優(yōu)組合，選擇方差分析顯著的因素繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖3。

圖3 各因素交互作用對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interactions between each factors on lipase stability

由圖3可知，硫酸鎂添加量與丙三醇添加量、果糖添加量與丙三醇添加量、果糖添加量與硫酸鎂添加量這3組交互作用項(xiàng)的曲面圖均為陡峭的凸面，說明這3組穩(wěn)定劑的交互作用都顯著。由圖3a可知，與丙三醇添加量方向上的響應(yīng)曲面相比，硫酸鎂的曲面比較陡，這說明硫酸鎂比丙三醇添加量對(duì)酶活的影響大。由圖3b可知，與丙三醇添加量方向上的響應(yīng)曲面相比，果糖的曲面比較陡，這說明果糖比丙三醇添加量對(duì)酶活的影響大。由圖3c可知，與硫酸鎂添加量方向上的響應(yīng)曲面相比，果糖的曲面比較陡，這說明果糖比硫酸鎂添加量對(duì)酶活的影響大。通過響應(yīng)面軟件對(duì)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到脂肪酶穩(wěn)定劑的最佳保存條件為3.54 mol/L丙三醇，0.14 mol/L硫酸鎂，果糖4.96%，在此條件下保存48 h，相對(duì)酶活預(yù)測(cè)值為72.92%。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)條件，并根據(jù)實(shí)際條件進(jìn)行優(yōu)化，在丙三醇3.54 mol/L，硫酸鎂0.14 mol/L，果糖5%的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到在此條件下保存48 h后的相對(duì)酶活為72.90%，與預(yù)測(cè)值72.92%接近，說明該模型能較好的預(yù)測(cè)復(fù)合穩(wěn)定劑維持脂肪酶保存穩(wěn)定性的情況。對(duì)于單一穩(wěn)定劑而言，其保護(hù)能力有限，而復(fù)合穩(wěn)定劑因協(xié)同作用能從多方面發(fā)揮保護(hù)作用，從而起到較好的效果。

3 結(jié)論

由于脂肪酶的穩(wěn)定性較差，不利于其有效、廣泛的使用，因此，研究脂肪酶的保存穩(wěn)定性，尋找最佳的保存方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)室溫條件下黑曲霉C2J6脂肪酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，其在復(fù)合穩(wěn)定劑中的穩(wěn)定性優(yōu)于單一穩(wěn)定劑。酶液中添加復(fù)合穩(wěn)定劑的最佳組合：丙三醇3.54 mol/L，硫酸鎂0.14 mol/L，果糖5%，此條件下保存48 h后，脂肪酶的相對(duì)酶活達(dá)72.90%。此法可以為黑曲霉C2J6脂肪酶在低溫及室溫下的長期保存提供參考，有利于后期脂肪酶的研究及應(yīng)用。

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